摘要：新设计了一种多肽C-端衍生物的合成方法。本方法结合了Fmoc-SPPS技术与TAEC技术的优点, 室温反应, 反应条件温和, 易于监测, 反应过程中所需采取的保护基最少, 后处理简单高效, 与正向固相合成互补, 可高效地合成多种多肽以及多肽C-端衍生物。

关键词： 多肽 反向固相合成 C-端衍生物 TAEC

引言

多肽是氨基酸以肽键依序相连的一类化合物。 近年来, 已发现众多多肽类药物, 因其药效高, 毒副作用低, 无蓄积中毒等优点, 在糖尿病、艾滋病、癌症、抗真菌、高血压、免疫调节以及其他疾病的治疗中发挥着重要的作用。通过对肽链的端基进行修饰, 获得不同的多肽端基衍生物, 是研发多肽药物的重要方向。对具生物活性多肽的端基进行修饰, 是提高多肽活性, 增加多肽稳定性的重要渠道。如H- Tyr-Pro -Trp-D -Val-OH和H-Tyr-Pro -Phe-D -Val-OH的C-端苄酯, 具有比母体药物高3 ~ 4倍的阿片受体亲和力［1］; 胸腺五肽的C-端羧基与2-氨基十四烷酸及其二聚体相连接而得到的衍生物脂溶性以及耐酶性更强, 与母体药物相比具有更好的生物利用度［2-3］。

多肽固相合成法 ( Solid Phase Peptide Synthe- sis, SPPS ) 是M errifield教授于1963年创立的。经过几十年的发展完善, 现已成为多肽合成领域中的重要技术手段。与传统液相合成相比, SPPS具有反应过程中不需对中间体进行分离纯化、可采用过量底物来取得较高收率、反应过程易于监测等优点［4-5］。其中Fmoc -SPPS方法采用9 -芴甲氧羰基 ( Fmoc) 作为保护基, 反应条件温和, Fmoc基团易于脱去, 后处理简单, 可利用Fmoc基团特有的紫外吸收波长跟踪反应过程, 是目前最常用的SPPS方法［6-7］。根据肽链的延长顺序, 从C-端至N-端延长为正向合成, 从N-端至C-端延长为反向合成 ( In- verse Solid Phase Peptide Synthesis, ISPPS ) 。正向SPPS合成即多肽的C -端通过Linker与树脂交联在一起, 逐步往N-端延长肽链。由于整个合成过程中C -端一直与树脂相连, 所以无法对C -端进行修饰。 ISPPS则是将肽链N -端氨基通过Linker与树脂相连，再对C-端羧基进行活化并与后续C-端保护氨基酸的 α-氨基形成肽键从而实现肽链的延长。肽链合成结束后, 肽链N-端仍与树脂相连, 可使肽链C- 端羧基活化并与其他化合物或多肽片段反应, 从而方便有效地实现正向SPPS难以完成的多肽C-端衍生物的合成以及通过C-端进行多肽片段连接［8］。 在反向固相合成中, 固相合成的特点与优势均可充分地保持与发挥。

转移活化酯技术 ( Transfer Active Ester Conden- sation, TAEC ) 是ISPPS的核心技术 ( 图1) , 通过亚硝基化合物将肽链C-端的酰肼转化为叠氮, 之后与活性试剂HOCt形成肽链的活性酯, 与后续氨基酸酰肼衍生物的游离氨基或其他试剂的活性基团缩合从而实现肽链的延长或者C-端的修饰［9-10］。转移活化酯耦联技术可采用侧链最低限度保护的肽链进行反应, 反应条件温和, 克服了传统叠氮法因强酸反应条件、反应时间长等而引起叠氮分解所产生的副反应等弱点［11］。进行C-端衍生物合成及片段连接时, 肽链所含氨基酸中的胍基 ( -NHC ( NH2) = NH) , 亚氨基 ( = NH) , 酚羟基, 醇羟基等侧链功能基团都不需进行保护［12］。另外, 由于采用了高效耦联试剂HOCt, 反应条件温和, 使多肽合成收率显著提高, 且反应中不会引起手性中心的消旋［13］。

TAEC技术现已经成功应用于多种类型的多肽C -端衍生物的合成, 如蛋白质化学合成中的关键中间体多肽硫酯、酶催化多肽合成中的多肽三氟乙酯、 多肽醛合成中具有重要作用的N-甲基-N-甲氧基酰胺。在肽链C-端片段连接方面, 利用TAEC技术也合成了各种特殊分枝多肽以及长序列链状多肽［14］, 如包含了76个氨基酸的泛素 ( Ubiquitin) 衍生物。

图1 TAEC技术

1 实验

1. 1氨基酸酰肼衍生物的化学合成 ( 以H-LeuNHNH-Fmoc为例)

称取H-Leu-OH ( 0. 658 5 g, 5 mmol) 置于圆底烧瓶, 取Na OH ( 0. 375 0 g, 7. 5 mmol, 1. 5 eq) 以10 m L水溶解, 转移至圆底烧瓶, 置于冰浴中。称取 ( Boc) 2O ( 1. 6350 g , 7. 5 mmol, 1. 5 eq) 以10 m L丙酮溶解, 逐滴加入到上述氨基酸中, 搅拌反应2 h后撤掉冰浴, 室温搅拌6 h。以TLC-茚三酮显色监测反应。反应完毕减压抽干丙酮, 放冷之后, 以1 mol / L的HCl水溶液调p H至5, 用乙酸乙酯萃取3次, 饱和食盐水洗涤以及无水Na2SO4干燥。过滤, 减压浓缩, 用EA /PE重结晶得Boc-Leu-OH 1. 11 g , 产物为白色粉末状固体, 收率95. 2% ; Rf= 0. 65 ( DCM ∶ M e OH = 1∶ 1) 。

称取Boc-Leu-OH ( 1. 156 0 g, 5 mmol) , HOBt ( 0. 675 0 g, 5 mmol, 1 eq) 置于圆底烧瓶, 以15 m L无水DCM溶解, 加入DIC ( 0. 800 0 m L, 5 mmol, 1 eq) , 溶液先变澄清, 稍后变浑浊, 活化1. 5 h之后加入Fmoc-NHNH2 ( 1. 220 0 g, 5 mmol, 1 eq) , 室温搅拌6 h。以EA /PE = 3∶ 1展开显示反应完毕。滤除反应生成的脲, 依次以0. 1 mol/L的Na HCO3水溶液、0. 1mol/L的HCl水溶液、饱和食盐水洗涤反应液3次, 无水Na2SO4干燥。过滤, 减压浓缩, 用EA / PE重结晶, 得Boc-Leu-NHNH-Fmoc 2. 08 g , 产物为白色粉末状固体, 收率89% ; Rf= 0. 6 ( EA ∶ PE = 3∶ 1) 。

取5 mmol Boc-Leu-NHNH-Fmoc ( 2. 337 8 g, 5 mmol) 置于圆底烧瓶, 加入DCM 10 m L 、TFA 10 mL , 室温搅拌反应0. 5 h。以DCM / EA = 3∶ 1展开显示反应完毕。减压浓缩, 用EA /PE重结晶, 得H-Leu-NHNH-Fmoc的三氟乙酸盐1. 97 g , 产物为白色粉末状固体, 收率85% ; Rf= 0. 5 ( DCM ∶ M e- t OH = 4∶ 1) 。

依据此方法, 可制得其他大多数氨基酸的Fmoc酰肼衍生物, 见图2。

图2氨基酸Fmoc酰肼衍生物的合成

1. 2树脂与Linker的连接以及连接效率的检测

将三光气 ( 1. 180 0 g, 4 mmol) 溶于60 m L DCM中, 对硝基苯酚 ( 1. 390 0 g , 10 mmol, 10 eq) 与三乙胺 ( 2. 780 0 m L, 20 mmol, 5 eq) 溶于80 m L DCM中。冰盐浴 ( m冰∶ m盐= 1 ∶ 1 ) 下, 将对硝基苯酚溶液逐滴滴加到三光气溶液中开始反应, 反应过程中使反应液保持碱性, 搅拌5 h左右, TLC监测反应完成, 停止反应。以DCM分3次洗涤反应瓶中的黄色物质, 合并DCM溶液, 依次以冰水、饱和食盐水各洗涤3次, 无水硫酸钠干燥。过滤, 浓缩减压, 得黄色固体。以EA /PE重结晶, 得对硝基苯基氯甲酸酯1. 070 0 g, 收率55% ; Rf= 0. 80 ( EA ∶ PE = 1∶ 2) 。

将Wang resin ( 5. 570 0 g, 10 mmol, Loading = 1. 800 0 mmol / g ) 投入多肽固相合成管, 加入适量无水DCM预先溶胀20 min。溶胀完毕抽掉DCM, 之后重新加入10 m L无水DCM。同时将对硝基苯基氯甲酸酯 ( 6. 030 0 g, 30 mmol, 3 eq) 与吡啶 ( 40. 000 0 mmol, 4 eq) 溶于30 m L无水DCM中。 将对硝基苯基氯甲酸酯的DCM溶液加入到多肽固相合成管中, 室温震揺过夜。将反应液抽滤, 依次以DM F、DCM 、乙醚各洗涤树脂5次, 真空干燥, 备用。

Linker与树脂连接效率 ( Loading ) 的检测: 根据朗伯 – 比尔定律可推算得Loading计算公式

, m为所取树脂质量, 单位为mg。 Loading的单位为mmol / g 。

取少量干燥过夜的树脂3份, 精密称重, 置于5 m L的容量瓶中, 加入20% 的哌啶/ DM F溶液定容, 另取一容量瓶, 加入5 m L 20% 的哌啶/DMF定容做为空白, 同时超声3 min。静置, 取上清液50 μL置于10 m L容量瓶中, 以DMF定容, 摇匀, 测量紫外吸收。对硝基苯酚在423 nm处有最强吸收, 摩尔吸光系数为32 800。3次测量取平均值得Loading = 1. 260 0 mmol / g , 反应效率为70% 。

树脂与Linker相连接之后, 树脂上仍然存在许多未反应的活性位点 ( 原Loading为1. 800 0 mmol/g, 反应后Loading为1. 2600 mmol/g) , 这些活性位点将干扰后续的反应, 需对其进行封闭。在上述多肽合成管中加入40 m L DCM, 醋酸酐 ( 5. 600 0 m L, 60 mmol, 6 eq) , 室温震揺6 h, 停止反应。将反应液抽滤, 依次以DMF、DCM、乙醚各洗涤5次, 置于真空干燥器中干燥, 备用。

1. 3第一个氨基酸酰肼衍生物与树脂的连接以及连接效率的检测

参考将Lys侧链的 ε-氨基连接到树脂上的方法, 将第一个氨基酸酰肼衍生物的氨基连接到树脂上［15］。以H-Leu-NHNH-Fmoc为例, 将连有Linker的Wang resin ( 1. 2000 g, 1. 500 0 mmol, Loading = 1. 260 0 mmol / g ) 置于多肽固相合成管中, 加入适量的无水DCM溶胀10 min, 抽掉DCM, 重新加入8 m L无水DCM作为反应液。加入4-二甲氨基吡啶 ( DMAP, 0. 1 eq) , 反应液变黄, 室温震揺1 h之后, 将H-Leu-NHNH-Fmoc ( 1. 653 0 g, 4. 500 0 mmol, 3 eq) , DIEA ( 2. 090 0 m L , 12 mmol, 8 eq) 以8 m L无水DMF溶解后转移到固相合成管, 封闭, 室温震揺8 h, 停止反应。将反应液抽滤, 依次以DMF、 DCM 、乙醚洗涤5次, 每次洗涤都要浸泡适当时间, 抽干, 置于真空干燥器中干燥, 备用。

1. 4多肽以及多肽C-端衍生物的合成

第一个氨基酸连接到树脂上之后, ISPPS按图3以及表1所示进行, 目标产物合成之后, 加入3倍量的TFA, 室温震揺1. 5 h将产物从树脂上切下, 以甲醇/乙醚重结晶纯化。以质谱确定分子质量, HP-LC确定纯度。

图3以氨基酸Fmoc酰肼衍生物为原料进行反向固相合成

表1以氨基酸Fmoc酰肼衍生物为原料进行反向固相合成操作

2 结果与讨论

2. 1实验结果

根据本文所述方法, 本实验室合成的多肽以及多肽C-端衍生物, 见表2。

表2按本文方法合成的多肽以及多肽C-端衍生物

2. 2讨论

在实验过程中发现, 以对硝基苯基氯甲酸酯作为Linker有三大优势, 首先由于硝基的存在, 使得对硝基苯酚基团极易被亲核试剂取代, 反应速度以及反应效率大大提高; 其次由于对硝基苯酚基团具有很强的紫外吸收, 可大大提高Loading检测的准确度; 再次Wang resin的羟基易与Linker的酰氯基团反应, 使得树脂与Linker的连接效率显著提高, 可高达70% 以上。

选择氨基酸Fmoc酰肼衍生物作为反向固相合成的原料是由其本身性质决定的。其氨基游离羧基以Fmoc-肼基保护, 符合反向固相合成的要求; Fmoc基团具有显著地紫外吸收 ( 301 nm ) , 易于通过TLC或者HP-LC监测反应过程; 且Fmoc基团在碱性条件下易于脱除, 反应条件温和, 从而使酰肼游离, 与后续的TAEC技术相匹配, 可方便有效地实现肽链的延长或者C-端衍生物的合成。

在肽链延长过程中, 由于TAEC技术对传统叠氮法的改进, 引进实验室自制的高活性耦联试剂HOCt, 反应不需高温以及强酸环境, 可避免许多传统方法中容易发生的副反应, 如消旋; 另外由于反应条件温和, 氨基酸侧链中的醇羟基 ( 丝氨酸) , 酚羟基 ( 酪氨酸) , 胍基 ( 精氨酸) 等基团不需进行保护, 可大大提高多肽合成效率。肽链合成结束后, 通过对C-端的活化, 可便捷高效地合成多种类型的C-端衍生物, 如表2所述的苄酯, 乙酯, 硫酯, 以及酰胺类衍生物。

3 结论

本方法以氨基酸Fmoc酰肼衍生物为原料进行ISPPS, 结合了固相合成法与Fmoc策略的优势, 通过对传统叠氮法改进而创立了TAEC技术, 使得整个反应过程条件温和, 后处理简单, 只需对树脂进行反复洗涤, 不需对每一步中间体进行分离纯化, 极大地提高了合成效率; 又因引用了自制的的高效耦联试剂HOCt, 耦合效率大大提高且不会引起氨基酸手性中心的消旋; 虽然反应过程中仍有许多副反应发生且反应总体收率不高, 但是建立了反向合成的新方法, 与传统正向SPPS合成互补, 可快捷高效地及通过C-端进行片段连接, 为多肽及其C-端衍生物合成常规SPPS方法难以合成的多肽C-端衍生物以的合成提供了新的路线选择。

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