1 “困难序列”形成的主要原因
根据形成原因的不同，多肽“困难序列”可以分为随机和非随机两种类型［5］，随机型“困难序列”与氨基酸疏水性及立体位阻有关。当氨基酸的
立体位阻较大（如氨基酸的侧链具有较大保护基）时，酰化试剂扩散困难；或树脂的负载量较大时，树脂上的肽链溶剂化不完全，偶联结果都很差
［5］。随机困难肽可以通过疏水性参数来粗略表示［6］，现在仍没有一条“黄金规则”能准确预测。一般认为，当疏水性参数达到正数，其合成
就相当困难［7］。非随机型“困难序列”是指易形成具有稳定且特异性 β-折叠结构的肽链序列。该类序列的肽链在一定长度时很容易发生氢键缔
合，且与树脂载体之间也容易出现分子聚集现象，多肽分子的氨基可能埋没在二级结构的深处，进而阻止缩合反应，此现象常出现在难溶多肽的合
成中［4，8］。使用 9-芴甲氧羰基（Fmoc）保护的氨基酸合成多肽时容易形成这种 β-折叠结构，合成过程需要改变反应条件如提高温度等破坏这
种构型，但这可能会导致产物消旋化或提前脱除Fmoc保护等不良反应［7］。 2 解决“困难序列”多肽合成困难的方法解决“困难序列”多肽合成
困难的方法有很多，可以从改变反应体系、改变反应条件、改变合成策略、采用新的合成技术手段等方面进行。 2. 1 改变反应体系2. 1. 1 使用
混合溶剂 多肽树脂在溶剂中达到充分溶胀状态时，有利于缩合反应的进行。当选用如N- 甲 基 吡 咯 烷 酮（NMP）、N，N- 二 甲 基 甲 酰 胺（
DMF）、二 甲 亚 砜（DMSO）、N，N-二 甲 基 乙 酰 胺（DMAc）等受氢溶剂时，其羰基（C=O）与肽链上的N-H 可以形成氢键，从而抑制了肽链自
身形成氢键而造成的聚集，进而抑制 β-折叠的生成。因此，选用 合 适 的 混 合 溶 剂 ，比 如 DMSO/DMF、6N 胍 啶/DMF、异丙醇/DMF、二氯
甲烷（DCM）/DMF/NMP、三氟乙醇（TFE）等有助于缩合反应的进行。黄惟德在《多肽合成》一书中提到，DMF为溶剂的反应液中加入 20％体积的三
氟乙醇（TFE）可帮助接肽速率提高［9］。朱亮亮等在大位阻氨基酸Fmoc-Arg（Pbf）-OH与Rink Amide-AM树脂的高效缩合中以DMAc/DCM为反应溶剂
，连接率高达93％［10］。 2. 1. 2 使用溶胀性能更好的树脂 当树脂的负载量较大时，树脂上的肽链溶剂化不完全，偶联结果很差［5］。使用溶
胀性较好的树脂，同时减少树脂担载量，有利于“困难序列”多肽的合成。比如Winkler等 在 合 成“ 困 难 序 列 ”多 肽 K5（ 序 列 ：
CGGKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKE）时，采用 PEG-PS 树脂代替常规的 PS/DVB 树 脂，使得粗肽收率有了显著性提高［11］。然而，由于
成本高昂，这种方法不适合于大规模的工业生产［12-13］。 2. 1. 3 选用高效缩合试剂 选用高效缩合试剂，可以有效地促进缩合反应的顺利进行
，也是解决“困难序列”多肽合成困难的一种常见方案，见图1。通常DIC的反应活性低于HBTU，HBTU的反应活性低于TBTU、PyBOP和HATU［14-15］
。所以，在反应活性比较低的时候，可以选择高活性的缩合试剂。
2. 2 改变反应条件
2. 2. 1 提高反应温度 提高反应温度有助于降低链聚合现象。BACSA B等［16］在合成1个九肽的实验中发现将合成温度提高到 60 ℃左右，最终产
品的纯度可达到 83%。然而，提高反应温度会导致新的不良反应的发生，比如侧链保护基的断裂［17］。所 以，在尽可能减少不良反应的情况下，
可以提高反应的温度。 2. 2. 2 调节反应 pH 值 调节反应 pH 值能改变多肽在溶剂中的溶解度，从而提高“困难序列”多肽的合成效率。比如
QIN X 等［18］、AJIKUMAR P K 等［19］研究了体系的 pH 值对多肽收率的影响，发现根据多肽序列中酸性和碱性氨基酸的数量，适当调节溶剂的
pH值，可以提高肽链的溶解性，促进反应的进行。然而，由于在该 pH值条件下，多肽保护基可能不稳定，所以不常使用［20］。 2. 2. 3 使用高
离液盐 高离液盐能破坏肽链间的氢键，从而破坏 β-折叠结构，提高“困难序列”多肽的合成效率。常见的高离液盐有尿素、LiCl、NaClO4 等。
比如，WESTALL F C等［21］在合成“困难序列”多肽时，发现加入尿素之后可使 Asn 及 Glu 的缩合率由70％提高至100％。这可能是由于尿素具
有受氢能力，干扰了肽链上的氢键缔合，从而促进了多肽的合成。然而，使用高离液盐会降低反应液的浓度，对反应速率有一定影响。2. 3 改变合
成策略
2. 3. 1 片断合成法 常规多肽固相合成，是从碳端开始按照氨基酸的顺序依次合成。当遇到“困难序列”时，采用片段合成法先制备带有保护基的
中间序列片段，再经过进一步活化、缩合得到保护的多肽，最后脱去保护基得到目标多肽。片段合成要考虑多肽片段的长短、连接位点和固相载体
这 3 个关键因素。由于肽段羧基端氨基酸比氨基端氨基酸更容易发生消旋反应，因此首先选择多肽片段 C末端的氨基酸。适合做C末端的氨基酸有
Gly（甘氨酸）、Pro（脯氨酸）、Glu（谷氨酸）、Leu（亮氨酸）和Asn（天冬酰胺）等［22］。周建华等［23］以王树脂为固相载体制得 25-34
肽树脂；以 2-氯三苯甲基氯树脂为固相载体制得 1-11、12-16 和 17-24 等 3 个片段的全保护肽；然后将 3 个片段的全保护肽按照肽序依次缩合
到 25-34 的肽树脂上，经三氟乙酸切割并脱除侧链保护基得特立帕肽粗品。SHI L等［24］采用片段合成法顺利地合成了阮病毒蛋白片段。张颖等
［25］在合成含有 3 股 β 折叠的齐考诺肽（25 肽，序列：CKGKG AKCSR LMYDC CTGSC RSGKC-NH2）的过程中，采用固相合成得到4个片段，分别
是［19-25］A、 ［12-18］B、［6-11］C 和［1-5］D，再将 B、C、D 依次偶联到肽树脂A上，最后从树脂上裂解得到线形粗肽。该方法相对于传统
的逐步缩合方法，缩短了合成周期，提高了粗肽的收率和纯度，为长肽的合成难题提供了可行性的解决方案。 2. 3. 2 引入化学修饰的肽链 引入
化学修饰的肽链，将“困难序列”多肽的高级结构暂时性破坏，促进肽的溶解，从而有利于多肽的合成。比如，当肽链中含有脯氨酸片段时，缩合
形成的酰胺键没有可以形成氢键的质子，脯氨酸的 α 碳原子处在五元环的刚性结构中，从而抑制了 β-折叠结构的形成，所 以，在合成“困难序
列”时可以考虑引入脯氨酸来减少合成的难度。WHITE P 等［26］在合成一些较长多肽序列（95肽）的时候引入伪脯氨酸二肽结构（类似脯氨酸结
构）保护氨基酸来改善聚集问题，见图 2。Ser、Thr和Cys 3个氨基酸可以和序列中邻近的氨基酸形成一个伪脯氨酸二肽（fPro），肽链在树脂上组
装完成后，放在 TFA 溶液中搅拌，将多肽从树脂上裂解下来，同时恢复正常的序列，不会影响多肽的性质［27-28］。经典的“困难序列”多肽合
成策略
3. 1 胸腺法新的合成 胸腺法新（胸腺肽 α1）的 序 列 为 Ac-SDAAV-DTSSE-ITTKD-LKEKK-EVVEEAEN-OH，是一个 28 肽。主要用来治疗慢性乙型
肝炎，具有良好的免疫调节作用［36］。胸腺法新的酸性残留位置、疏水性氨基酸的连续存在（Thr-Thr、Val-Val）
和需要大量的保护基（20 个侧链保护基）等造成了其固相合成的困难。采用Fmoc策略合成时，C端第1 个氨基酸会用到 Fmoc-Asn（Trt）-OH，立体
位阻很大。连续疏水性缬氨酸（Val-Val）的出现，会造成β-折叠的生成；已有大量的实验证明，偶联至第9个氨基酸（K）时，多肽的纯度会急剧
下降，胸腺法新是一个典型的“困难序列”多肽（图4）。自胸腺法新被发现以来，多位研究者采用不同
的策略致力于该“困难序列”的合成。最早来自于1980 年美国罗氏公司和美国洛克菲勒大学的研究者，他们对主链氨基采用Boc保护的固相合成法
，总收率不到 7%［37］，后经 WANG T W 等的改进（采用羟甲基-苯乙酰胺甲基树脂，增强了肽-树脂键的稳定性），纯化收率提高到 34%。然而，
采用 Boc 保护基的固相合成法，要频繁用到 TFA 和 HF 等腐蚀性气体，污染大，肽树脂不稳定，如今已很少被采用。漳州未名博欣生物医药有限公司-客户肽，多肽定制，多肽合成
为了提高胸腺法新的产率，1985年罗氏公司的FELIX A M 等［39］
尝试了片段合成法，然而，最后 4
步的收率仅为 30%。1988 年德国图宾根大学的ECHNER H等［40］
报道了用高效偶联试剂Bop做活化剂，氨基采用 Fmoc 保护，侧链采用 t-Bu 或 Boc 保护
的固相合成法，粗品收率达到 76%。但经过纯化后，纯品收率比较低。
在这些解决方案中，最成功的莫过于刘标等，他们以 HBTU/HOBt/DIPEA 体系作为缩合试剂，在易形α螺旋和β转角的肽序位置，通过采用HOBt/DIC
补投的方法促使偶联反应完全。以茚三酮显色的 法 对 反 应 进 行 监 控 ，获 得 的 粗 肽 纯 度 为67. 2%。以反相液相色谱法为主要分离手
段，通过多步离实现纯化。胸腺法新产品纯度达 99. 5%以上，总收率为 17. 2%［41］。另一个成功的解决方案是209年西班牙生物医学研究所和瑞
士Lonza公司合作提出的，他们采用改进的Fmoc/t-Bu的固相合成法，端的 Asp主链羧基用 t-Bu保护，侧链羧基连接到 PEG 氨基树脂上，即采用
Fmoc-Asp-OtBu 作为第一个入的保护氨基酸。该方法的粗品纯度达到90%［42］。 3. 2 扶素康的合成 扶素康是根据 HIV 膜蛋白gp4的结构设计的
新一代膜融合抑制剂，是一个36肽 ，其 序 列 为 ：SWETW-EKEIE-NYTKQ-IYKILEESQE-QQDKN-EKDLL-E［4］。然而，由于肽链中含有大量的疏水性
氨基酸（W、T、I、L）和立体位阻很大的氨基酸（W、Q、N），以及需要大量的保护基（30 个侧链保护基）等造成了其固相合成的困难。扶素康的
早期合成采用固相逐步化学合成法。采用 Fmoc保护策略、王树脂为固相载体、反应溶剂为 DMF、HBTU/HOBt/DIPEA 为缩合剂，保护氨基酸 2倍过量
进行缩合反应、TFA/苯酚/EDT/水为切割条件，得到的粗肽纯度和收率都很低［44］。为了提高扶素康的产率，郭一琼等［44］采用片段合成的策略
。他们以 2-氯三苯甲基树脂和王树脂为固相载体，HBTU/HOBt/DIPEA 为缩合剂，DMF 为反应溶剂，用 HOAc（乙酸）/TFE/DCM 将全保护多肽片段由
树脂上切割下来。将全保护多肽片段依次偶联，再用 TFA溶液除去保护基。该条件下合成的扶素康粗品收率达 67. 31%，按标准曲线定量分析粗品
纯度为38. 75%［44］。
分享来源：赣 南 医 学 院 学 报
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