1.前言
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多肽是由多个氨基酸通过酰胺键相连形成的化合物，可通过基因重组表达、生物提取、化学合成等方法制备。多肽类药物的分子是 介于小分子化学药物和蛋白质药物之间的一种特殊药物。与小分子化学药物相比，多肽具有更高的功效、选择性和特异性以及更低的代谢毒性，尤其在治疗复杂疾病方面优势更加明显；与蛋白质药物相比，多肽具有更低的免疫原性，能够更渗透到目标组织，并且用量少节约生产成本。因为多肽类药物的独特生态位，填补了小分子化药和蛋白质药物之间的缺口，所以在医药领域备受关注并且常被应用于治疗糖尿病、骨质疏松症、癌症、多发性硬化症、慢性疼痛、HIV感染等多种疾病中。随着多肽行业的兴起，大量多肽类的药物产品不断涌出，针对多肽的相关法规文件也不断更新和扩充。在1994年由美国食品药品监督管理局（FDA）分布了第一条有关合成多肽类药物的研究指导原则《Guidance for Industry for Submission of Chemistry, Manufacturing, and Controls Information for Synthetic Peptide Substances;2021年《美国药典》USP发布【(1503) Quality Attributes of Synthetic Peptide Drug Substances】; 2022年1月《美国药典》USP发布<1504>“Quality Attributes of Starting Materials for the Chemical Synthesis of Therapeutic Peptides”；欧洲药品管理局（EMA）于2022.09.20发布了有关合成多肽药物研发及生产指南概念文件《Concept Paper on the Establishment of a Guideline on the Development and Manufacture of Synthetic Peptides》。
在国内，于2007年由药品审批中心发布《合成多肽药物药学研究技术指导原则》，但随着质量源于设计理念的深入、研发水平的提升和技术设备的变革，该版指导原则已不能满足现阶段的研究和监管需求。因此，2023年2月药审中心发布了新修订的《化学合成多肽药物药学研究技术导原则（试行）》。综上所述的这些法规文件为研发多肽类药物提供了重要的参考和指引。
众所周知，多肽类药物主要特点就是具有活性肽，它是产生药效的物质基础，因此在肽药物的开发过程中，对活性肽（API）进行质量控制是非常重要的，然而肽相关杂质的控制又是质量控制中的重要一项，杂质在临床试验阶段影响临床试验样品的安全性和有效性，在药物研发阶段早期会影响药效判断，导致错误的结论。
2.合成多肽药物类的杂质分类
在NMPA发布最新一版《化学合成多肽药物药学研究技术指导原则》（试运行）中第五项“质量研究与控制”中有提到杂质。本指导原则中将化学合成多肽的杂质分为肽相关杂质和非肽杂质。
2.1肽相关杂质的分类以及产生机制
肽相关杂质：是指与目标分子结构有关的杂质，是反映多肽化学纯度的重要指标之一。肽相关杂质一般由以下几点产生：
（1） 由起始物料引入；
（2） 生产工艺副反应；
（3） 长期放置过程中降解。
肽相关杂质一般包括：缺失肽、插入肽、错结肽、差向肽、Asp/Asn相关杂质、焦谷氨酸、聚合物、含硫杂质等。下表为与肽相关杂质的类别、描述以及来源：
2.1.2解析各类别杂质产生机制以及杂质鉴定方法
l 2.1.2.1缺失肽
缺失肽是缺失一个或多个所需氨基酸的多肽，造成这种情况一般由两种原因：
第一，不完全去除氨基酸的瞬时保护集团、即将结合的氨基酸活化不足或交联效率低都会导致缺失肽的产生。缺失肽的鉴定方法，即质谱中观察到的杂质与目标肽之间的质量差为所缺失氨基酸分子量减去水。
第二，多肽化合物在遇到高温或pH变化时可能发生肽键断裂，产生断裂肽，有研究表明碱性条件最易引起肽键断裂。断裂肽的鉴定相对简单，通过杂质与母肽的分子量差可以推断是哪个酰胺键断裂。
l 2.1.2.2插入肽
在合成多肽交联过程中通常会将氨基酸过量投料，如果过量的氨基酸未被充分洗涤或者反应时间过长会将氨基酸再次交联，产生插入肽。对于插入肽的鉴定方法，即质谱中观察到的杂质与目标肽之间的质量差为所插入氨基酸分子量减去水。
l 2.1.2.3错结肽
当固相反应过程中既发生氨基酸缺失又发生氨基酸插入时就会产生错结肽。
l 2.1.2.4差向肽
差向肽是指序列中含有1个或多个非预期手性构型的氨基酸残基所形成的杂质，其产生可能源于起始物料中的光学异构体，也可能是合成过程中氨基酸手性中心烯醇化或氮杂内酯化形成。差向肽杂质的色谱行为与主成分非常接近，分子量也与主成分一样，仅此分离和鉴定难度较大。可采用氘代试剂对多肽进行水解并衍生化处理，通过水解所得氨基酸的异构体的含量判断肽链中易发生消旋的氨基酸，通过定向制备可能的差向异构体肽进行有针对性的研究。
l 2.1.2.5 Asp/Asn相关
2.1.2.5.1天冬氨酸（ASP）是容易产生异构化的氨基酸，天冬氨酸容易因侧链失水或氨而环化到主链，形成琥珀酰亚胺，琥珀酰亚胺稳定性较差，易水解开环，在开环的过程可形成异构体，同时还会产生差向肽副产物，其生成机制与天冬酰胺脱酰胺相似。
2.1.2.5.2当多肽中含有天冬酰胺（Asn）或谷氨酰胺（Gln）残基时，可能脱去酰胺键形成谷氨酸或天冬氨酸残基，形成的机制有两种，一是直接水解（pH<5时容易发生），二是通过β转变（碱性条件下易发生），β转变通过主链中酰胺键的N原子攻击侧链上的羰基，形成琥珀酰亚胺环（氮杂内酯的一种），在碱性或中性条件下水解形成羧基。琥珀酰亚胺水解过程往往还伴随着两个副反应即异构化和外消旋化，最终形成4个分子量相同的异构体产物。脱酰胺杂质的鉴定主要通过质谱，检测到分子量+1 Da的杂质通常是脱酰胺杂质。
l 2.1.2.6焦谷氨酸是指N-端含有的谷氨酸发生环化形成吡咯烷酮羧酸。该杂质的鉴定可采用质谱，分子量较母肽减少17Da（脱去NH3）。
l 2.1.2.7聚合物
多肽分子间聚集和自结合可导致高分子量杂质也就是聚合物的形成。聚合机制有共价和非共价两种，非共价聚合通过静电或疏水相互作用形成，是一种中间状态，当溶液浓度、pH或离子强度发生变化时，这种作用力容易减弱或消失，聚合状态恢复到单体状态；当肽链中含有巯基或酪氨酸时可通过生成二硫键或形成二酪氨酸而引起共价聚合，共价聚合是一种稳定的聚合状态，不会随肽浓度或pH、离子强度等而改变聚合状态。聚合物杂质由于其分子量和体积的进一步加大，容易增加免疫原性，引起过敏性反应，因此应合理控制聚合物的含量。聚合物的检测通常采用体积排阻色谱，与质谱联用后可以判断其聚合体的倍数。
l 2.1.2.8含硫杂质
2.1.2.8.1二硫键氧化
氧化杂质是多肽在储存过程中接触氧气和光的情况下形成的，易发生氧化的氨基酸包括含硫氨基酸、组氨酸His、酪氨酸Tyr、色氨酸Trp。
①含有硫的氨基酸（甲硫氨酸、半胱氨酸Cys、胱氨酸）容易发生氧化反应，氧化途径有两种，一是生成二硫键，杂质分子量为母肽分子量2倍减2，二者生成亚砜、砜和磺酸，杂质分子量与母肽的分子量通常相差16Da、32Da或48Da（图A、B）。
②酪氨酸中酚羟基及临位均可成为氧化位点，氧化会生成2-氨基-3-(3,4-二氧环己-1,5-二烯基)丙酸，分子量增加14（图C）。
③组氨酸氧化有两种途径，一是咪唑环的双键氧化成羰基，其氧化杂质与母肽分子量相差16Da，另一种氧化途径是生成n -甲酰基犬尿氨酸，分子量相差48（图D）。
④色氨酸在氧化条件下可生成羟色氨酸（分子量增加16Da）或犬色氨酸（分子量增加4Da），犬色氨酸进一步氧化可生成羟基-甲酰犬尿氨酸（分子量增加48Da）（图E）。
2.1.2.8.2二硫键还原是指二硫键在还原剂存在的情况下发生还原反应，比如例如silane，被还原为相应的半胱氨酸，形成[M+2]的杂质。除此之外，Trp被还原也有可能产生[M+2]杂质。
l 2.1.2.9其他
2.1.2.9.1共价附着肽杂质：
在固相合成完成后永久性保护基团不完全去除将导致保护基共价附着在肽序列中，产生共价附着肽杂质。对于这类杂质的鉴定方法，如果质谱中杂质分子量与目标肽分子量相差56 Da，那么附着的保护基为tBu保护基，如果质谱中杂质分子量与目标肽分子量相差100 Da，那么附着的保护基为tBoc-TCS保护基。
2.1.2.9.2二嗪哌酮是指N端活性基团（通常为氨基）进攻β位主链酰胺键的羰基，形成二酮哌嗪类似物，得到缺失两个氨基酸的缺失肽，当N端氨基酸位阻较小时反应更容易发生。
2.2非肽杂质
非肽杂质是工艺过程中引入的与目标分子结构不相关的杂质，包括反应试剂和溶剂、金属催化剂、缩合剂等残留物，此类杂质的研究可参照小分子化学药物相关指导原则进行。
多肽药物在合成过程中，需使用不同类型的缩合剂、保 护基团等，此类物质在反应过程中可能生成含有警示结构的 小分子副产物。应制定合理的控制策略，例如，可采用具有 代表性的化合物或接近终产品工艺步骤生成的化合物进行 针对性的清除效力研究，以证明采用的分离纯化方式可有效 去除相应杂质。
[参考文献]：
[1] FDA：Guidance for Industry for Submission of Chemistry, Manufacturing, and Controls Information for Synthetic Peptide Substances.,1994年
[2] FDA：Guidance for Industry. ANDAs for Certain Highly Purified Synthetic Peptide Drug Products That Refer to Listed Drugs of rDNA Origin. 2021
[3] ICH Q7: Good Manufacturing Practice Guide for Active Pharmaceutical Ingredients. 2000
[4] ICH Q11: Development and Manufacture of Drug Substances (Chemical Entities and Biotechnological/Biological Entities). 2012
[5] ICH M7 (R1): Assessment and Control of DNA Reactive (Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic Risk M7. 2017
[6] (1503) USP-NF：Quality Attributes of Synthetic Peptide Drug Substances.2021年
[7]（1504）USP-NF：Quality Attributes of Starting Materials for the Chemical Synthesis of Therapeutic Peptides (PF Online).2021年
[8] 原国家食品药品监督管理局：《合成多肽药物药学研究技 术指导原则》.2007年9月
[9] 国家药品监督管理局：《化学合成多肽药物药学研究技术指导原则》（试行）2023年02月
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