摘要：综述了多肽合成中几种形成二硫键的方法。介绍了经典的空气氧化法、铁氰化钾氧化法和碘氧化法及近年来发展起来的二甲亚砜氧化法、三氟乙酸铊氧化法和氯硅烷-亚砜氧化法等方法的特点,同时还介绍了形成两对或多对二硫键的策略。
关键词： 二硫键 二硫键形成 半胱氨酸 氧化 多肽合成
两个半胱氨酸残基侧链之间形成的二硫键在维持多肽和蛋白质的空间构象及由此决定的生物活性中发挥着重要的作用。研究二硫键形成的方法一直是多肽合成方法学研究的热点和难点之一。
形成二硫键的实质是两个游离的巯基经氧化后形成硫-硫共价键。从化学反应机理上讲,这是一个自由基反应 [1] 。硫氢键比氧氢键容易断裂,不论有无催化剂存在,室温下用空气即可把硫醇氧化成二硫化合物。
在多肽合成中,二硫键的形成要复杂得多。由于多肽分子量较大,空间结构较复杂,它要求两个半胱氨酸在空间距离上接近。半胱氨酸的巯基非常活泼,容易产生副反应,多肽分子中的某些残基易被氧化或修饰,因此还需要选择合适的氧化剂。此外,其反应机理也比较复杂,既可能是游离基反应,也可能是离子反应 [2] 。
采用温和的氧化剂,如空气、二甲亚砜(DMSO)、N-碘代琥珀酰亚胺(NIS)和氰化碘(ICN)等氧化得到热力学控制的产物。采用较强的氧化剂,如碘、铁氰化钾[K3Fe (CN)6]和三氟乙酸铊[(CF3COO)3 Tl]等氧化则得到动力学控制的产物 [3] 。
本文对多肽合成中二硫键形成的各种方法作一介绍。
1 形成-对二硫键的方法
1.1空气氧化法
空气氧化法形成二硫键是多肽合成最经典的方法。在催产素、加压素和胰岛素的早期合成中,采用空气氧化法形成二硫键都取得了较好的效果 [4,5] 。一般方法是:将脱保护游离出半胱氨酸巯基的多肽溶于水中,在近中性或弱碱性条件下(pH值6.5～10),采用空气自然氧化,反应时间一般需要24小时以上。具体反应条件需在实验中探索。采用空气氧化法须将多肽控制在极稀的浓度下进行,以减少分子间聚合,反应得到热力学控制产物。此方法的优是:副产物为水,纯化方便。其改良的方法是采用二硫键的交换法,如以氧化型谷胱甘肽或氧化型二硫苏糖醇氧化多肽中的半胱氨酸形成二硫键,这是一种二硫键的交换反应,反应速度比空气氧化进行得快,但仍是一种平衡反应,氧化难以进行彻底。
在碱性溶液中难溶的富含精氨酸的肽或疏水性较强的肽以及在碱性溶液中易被破坏的肽,不宜采用空气氧化法 [6] ,应采用较强的氧化剂,如碘、铁氰化钾、三氟乙酸铊等进行氧化。
1.2铁氰化钾氧化法
铁氰化钾氧化法也是多肽合成中常用的一种形成二硫键的方法[7]。一般采用的方法是:将脱保护游离出半胱氨酸巯基的多肽溶于水中,用氨水调pH值至7～8,滴加铁氰化钾水溶液(2～4mol·L-1),室温反应60分钟左右,再滴加乙酸调pH值至弱酸性以终止氧化反应。此方法的优点是:将多肽浓度控制在较稀的情况下可以最大限度地避免分子之间形成二硫键。此法的不足之处是纯化较复杂。
Hope [8] 等在催产素的合成中首先介绍了此法,笔者采用此法合成鲑鱼降钙素和人降钙素基因相关肽都取得了满意的效果。
1.3碘氧化法
碘氧化法在多肽合成中的应用比较广泛 [9,10] 。一般采用的方法是:将多肽溶于25%的甲醇水溶液或30%的乙酸水溶液中,滴加10～15 mol·L-1的碘进行氧化,反应15～40分钟。由于Tyr、Trp、Met和His对碘很敏感,在氧化过程中应注意控制条件,氧化完毕后,应立即加入维生素C或硫代硫酸钠除去过量的碘。因此,对于含有上述残基的多肽,在采用碘氧化时宜特别小心。
碘可以直接将含有Cys(Acm)和Cys(Trt)的肽氧化形成二硫键 [11,12] ,但是对于含Cys(tBu)、Cys(4-MeBzl)和Cys(4-MeOBzl)的肽则不能直接氧化。Barlos等 [13] 对含Cys (Acm)和Cys(Trt)的多肽的氧化条件进行了优化,氧化过程在三种条件下进行:将肽从树脂上裂解下来后再氧化;在树脂上氧化后再裂解;在裂解的同时进行氧化。结果表明,采用在裂解的同时进行氧化的方法产率较高,纯化方便。
1.4三氟乙酸铊氧化法
Fujii等 [14～16] 发现三氟乙酸铊对硫原子有很强的亲合力,它在三氟乙酸中起弱酸和氧化剂的作用,能首先脱除Cys (tBu)、Cys(Ad)、Cys (Acm)、Cys (Trt)的保护基,然后氧化形成二硫键。一般采用1.0～1.2 mol·L-1三氟乙酸铊的三氟乙酸溶液进行氧化,冰浴中反应1小时。在氧化过程中,应加入甘油或茴香醚清除产生的碳正离子。此法对肽链中的His和Tyr无影响,但Met和Trp应事先保护为Met(O)和Trp(Mts),反应后,可用NH4I将Met(O)还原为Met,可用TMSOTf/TFA脱除Trp(Mts)的Mts保护基。此法的优点是:以三氟乙酸作溶剂能解所有的多肽,Tl3+溶于乙醚,易于用乙醚提取除去,从而使肽中不含Tl3+。但用三氟乙酸铊不能脱除并氧化Cys(Bzl),且对Cys(4-MeBzl)的氧化有副反应。Fujii等用此法合成了催产素(8肽,收率45%),urotensin (12肽,收率34%)和人降钙素基因相关肽(37肽,收率11%)。
1.5二甲亚砜(DMSO)氧化法
二甲亚砜是一种温和的氧化剂。采用二甲亚砜氧化形成二硫键是近年来引入多肽合成的一种新方法 [3] 。研究表明,二甲亚砜的存在有利于多肽的反向转折,从而有利于二硫键的形成。此法的副产物为易挥发的CH3SCH3和水,因此纯化方便,产率较高。氧化反应可在三氟乙酸和水中进行。
1.5.1采用三氟乙酸作溶剂
采用10%DMSO/TFA可在脱除侧链保护基的同时氧化含有Cys(Trt)、Cys (4-MeOBzl)、Cys(Dbs)和Cys(Bzh)的多肽形成二硫键。对含后三种Cys侧链保护基的多肽,一般在25℃反应12小时即完成脱保护及氧化。在相同条件下,对含Cys(Ad)和Cys(4-MeBzl)的多肽,不能采用此法氧化。被氧化多肽链中的,Trp需要进行保护,Met可能部分被氧化成Met(O)。对于含Cys(Trt)或游离出半胱氨酸巯基的多肽,氧化反应可在1小时内完成。Otaka等 [17] 用此法合成了催产素(8肽,收率73.5%)和人的降钙素基因相关肽(37肽,收率17%)。笔者采用此法合成人降钙素基因相关肽取得了与铁氰化钾相同的氧化效果,但其反应条件和纯化要简便得多。
1.5.2采用水作溶剂
DMSO可以与水混溶形成混合溶剂。通常用20%DMSO水溶液氧化速度比较合适,反应需1～4小时。此反应可在较大pH值(3～8)范围内进行,对碱性或疏水性强的肽尤其适合。此法对Met、Trp和Tyr无影响。
1.6氯硅烷-亚砜氧化法
Numata等 [18] 报道同时采用三甲基氯硅烷和亚砜可以将苯硫酚氧化成二苯基二硫化物,同时亚砜被还原成硫醚。Akaji等 [19] 又发现用三氯甲基硅烷和二苯亚砜作氧化剂,可将侧链保护的半胱氨酸,如Cys(Acm)、Cys(Tacm)、Cys(Bam)、Cys(tBu)和Cys(4-MeBzl)直接氧化成胱氨酸。Akaji等将此法引入多肽合成中,采用Acm基保护半胱氨酸的侧链,合成了催产素(8肽,产率56%)和人脑钠素(32肽,产率12%)。具体方法是:将多肽溶于三氟乙酸中,用l00mol·L-1的CH3SiCl3和10mol·L-1的Ph2SO作氧化剂,于25℃反应10分钟即可形成二硫键。在氧化过程中,肽链中的Met、Tyr、His和Trp(For)不受影响,未保护的Trp会有副反应产生。
1.7 N-碘代琥珀酰亚胺(NIS)氧化法
NIS可以直接氧化。该反应有两种机理:NIS对Cys(4-MeOBzl)的氧化是自由基反应;NIS对Cys(Acm)的氧化则通过亲电取代,首先形成RSI,再进一步形成二硫键(RSSR)。此反应与碘氧化机理不同,因为碘能直接氧化Cys (Acm),但不能直接氧化Cys(4-MeOBzl)。Bishop [2] 采用此法合成了加压素、人生长激素释放因子和apamin。一般方法是:将含Cys(Acm)或Cys(4-MeOBzl)的多肽溶于DMF或CH2Cl2中,以1.1 mol·L-1的NIS氧化反应2小时即可形成二硫键。
1.8氰化碘(ICN)氧化法
ICN易溶于水和有机溶剂的混合溶剂。如在CH3OH/H2O中,ICN有较大溶解度,容易形成I+,氧化能力更强。此法与碘氧化相比较,在相同条件下ICN用量较大(50～80mol·L-1),但产率高。此氧化法不影响Met,尤其适合氧化含有Cys(Acm)和Cys (Trt)的多肽。Bishop [20] 等应用此法合成了降钙素和表皮生长因子等三个多肽片段,效果较好。
1.9锍盐氧化法
在甲醇-水溶液或三氟乙醇-水溶液中,用10 mol·L-1的
可以将含有Cys (Acm)、Cys(4-MeOBzl)和Cys (Trt)的多肽先脱保护,然后氧化形成二硫键。Shih等 [21] 用此法合成了降钙素片段和sarafotoxin片段。
1.10 Npys氧化法
3-硝基-2-吡啶硫基(3-nitro-2-pyridylsulfenyl,Npys)作为巯基保护基团,对强酸(如HF和TFA)稳定,适合用于Boc/苄基保护策略 [22] 。Npys同时有活化巯基的作用,Cys(Npys)容易进攻游离的半胱氨酸巯基,形成二硫键。此法适用于分子内或分子之间的Cys(Npys)与Cys之间形成二硫键。Cys(Npys)很容易由Cys(R)(R=Acm、But、Trt和Bzl等)与Npys-Cl反应制得 [23] 。Ploux等 [24] 在P物质类似物的合成中用此法取得了较好的效果。
2 两对或多对二硫键形成的策略
在多肽合成中往往需要形成两对或多对二硫键,可采用一步氧化法和分步氧化法实现。
2.1一步氧化法
选择合适的氧化条件,可一步氧化形成两对或多对二硫键的正确配对结构,该结构往往就是具有热力学稳定性天然构象。Tam等 [3] 采用20%的DMSO水溶液氧化形成了defesin分子内的三对二硫键,得到了与天然结构同样活性的defensin(总产率14%)。一步氧化法虽然简便,但往往难以保证形成二硫键的正确配对。
2.2分步氧化法
若需要选择性形成两对或多对二硫键,可采用两组或多组不同的巯基保护基,利用其性质差异,分步氧化形成两对或多对二硫键。如某肽链中结构有四个半胱氨酸Cys1、Cys3、Cys11和Cys15,需分别在1、15位和3、11位之间形成两对二硫键。可在1、15位选用Cys(Acm),在3、11位选用Cys(4-MeBzl)。首先用HF脱保护，游离出3、11位的半胱氨酸巯基,以铁氰化钾氧化形成3、11位二硫键,然后采用碘氧化形成1、15位二硫键。Tamamura等 [25] 采用空气氧化法和二甲亚砜氧化法成功地合成了含有两对分子内二硫键的Tachyplesin-I。Akaji等 [26] 采用空气氧化法、碘氧化法和氯硅烷-亚砜氧化法合成了含有三对二硫键的人胰岛素。
3 小结
空气氧化法、铁氰化钾氧化法和碘氧化法是多肽合成应用最广泛的经典方法。DMSO氧化法、三氟乙酸铊氧化法、氯硅烷-亚砜氧化法和Npys氧化法均是近年来引入多肽合成中的新方法,其应用越来越多。氰化碘氧化法、NIS氧化法及锍盐氧化法尚处于研究探索中,在多肽合成中应用尚不多见。
二硫键的形成一直是多肽合成中的一个难点,目前尚无一种既简便又满意的方法。但从本文介绍的多种方法中,根据合成肽的序列特点,总能选择一种或几种较满意的方法来形成多肽分子中正确的二硫键结构。
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