✎ 前 言
噬菌体展示技术最早出现于1985年，目前该技术广泛的应用于抗体发现中。噬菌体展示技术看似简单实则细节非常多，其中抗原呈递策略是非常重要的环节。通过不同的抗原呈递策略，可以开发出满足不同需求的抗体。本期小编为大家带来噬菌体展示技术抗体筛选过程中抗原呈递的几种策略。
在噬菌体展示抗体筛选过程中抗原能否反应出天然构象是至关重要的。否则，开发出来的抗体最终只能识别构象改变之后的抗原，而不能识别天然构象的抗原。其次抗原表位能否完全暴露使其能与噬菌体充分接触也是需要考虑的问题，因此，噬菌体展示抗体筛选实验在开始进行之前需要考虑最佳的呈递策略。
1、直接包被的抗原呈递
直接包被是最简单也是最广泛使用的抗原呈递方式，抗原通过物理吸附直接固定在固相介质表面。在直接固定抗原的过程中，抗原被动地吸附于固相介质表面，这个过程抗原呈递是随机的，没有方向。然而蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合，主要靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用，因此疏水氨基酸丰富的区域更容易吸附。此外，这个过程还受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响，直接吸附，容易让一些表位被屏蔽。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。
直接包被是通过物理吸附，而物理吸附主要靠疏水，这个过程中可能会存在以下问题：(1) 改变抗原的构象，筛选到的抗体不能结合天然构像抗原，比如膜表面抗原；(2) 对于分子量小的抗原（多肽和小分子），抗原表位不能充分暴露，同时封闭蛋白（BSA和OVA）带来空间位阻，导致筛选不到合适表位的抗体或筛选到的抗体不能覆盖所有表位。
直接包被常用Coating buffer包括PBS，ddH2O，0.05mM碳酸盐缓冲溶液等，碱性buffer更容易让抗原吸附到固相载体上。
2、间接包被的抗原呈递
为了避免直接固定抗原带来的不利影响，在噬菌体展示抗体筛选过程可尝试使用间接固定法，即利用固相载体表面的捕获分子来固定抗原。
常用的间接固定方法有几种：
(1) 利用链霉亲和素和生物素之间的强共价反应，使抗原间接且稳定地附着在固相载体表面。生物素化有两种不同的策略：定点生物素化和随机生物素化。定点生物素化可利用Avi Tag实现体内/体外生物素化。使用定点生物素化可控制抗原与生物素的比例。然而当重组表达目标抗原困难或者当Avi Tag会干扰抗原潜在的表位时不能使用Avi Tag系统。随机生物素化是纯化抗原和生物素化试剂反应实现抗原和生物素之间的共价连接。随机生物素化更快更便宜，不能让抗原过度生物素化，过度生物素化抗原也可能会掩盖其重要的表位，抗原失活或者抗原聚集（图1）。
(2) 利用不同的肽标签和标记特异性捕获分子来实现抗原的间接固定。如his tag和Anit his tag系统，镍介质，以及最近出现的Spy Tag和Spy Catcher系统。Spy Tag和Spy Catcher系统是不可逆的、特异的，对各种条件如pH、温度和缓冲液具有强稳定性。
(3)对于小分子抗原如多肽，可将小分子与载体蛋白如KLH,BSA,OVA等偶联，用于抗原的呈递，让小分子充分的暴露。其次也可以将小分子与FC，GST，MBP融合表达，然后固定于介质表面。
3、通过完整细胞筛选的抗原呈递
对于跨膜蛋白，一般表达膜蛋白ECD区域来进行筛选，有时候我们会发现重组表达的ECD区域抗原蛋白筛选到的抗体并不能识别细胞膜上的抗原，主要原因是重组表达的抗原与细胞膜上的抗原构象不一致。为了保持细胞膜蛋白的构象，可采用HEK或CHO细胞构建瞬转或稳转过表达细胞系，或高表达肿瘤细胞系，来呈递抗原(图2)。然而使用整个细胞进行筛选会产生很多的非特异结合抗体，为了减少这种情况，可以使用低pH值的缓冲液进行洗涤以排除噬菌体外壳蛋白吸附的干扰。另外我们需要在筛选过程中保持细胞的活性以减少与死细胞和细胞碎片结合的非特异性抗体。
4、通过脂质体、纳米磷脂盘和VLPs呈递抗原
脂质体是一种由一个或多个磷脂双分子层膜包裹的水溶液组成的球形囊泡。利用脂质体呈递抗原需要从原生膜环境中提取抗原，并将提取的抗原转移到形成的脂质体上。纳米磷脂盘是纳米大小的盘状结构，由两个两亲螺旋蛋白带包围的磷脂双分子层组成，称为“膜支架蛋白”(MSPs)。纯化后的膜蛋白可以与磷脂和MSPs混合，得到携带膜蛋白的纳米磷脂盘。纳米磷脂盘为膜蛋白提供了一个稳定的环境，可以保存更长的时间。
VLPs是缺乏病毒基因组的非传染性、病毒样的多蛋白结构，包含病毒衣壳蛋白(图3)。靶膜蛋白可以在表达衣壳的宿主细胞表面瞬时过表达。与脂质体相比，VLPs更稳定，可以呈现更高密度的抗原。然而，VLPs的成本很高，商业上可用的VLPs很昂贵，而且有时难以进行生产。
✎ 结 语
在噬菌体展示抗体筛选过程中抗原的构象与抗原在最终应用中的构象之间的相似性至关重要。因此，在进行噬菌体展示抗体筛选实验之前需要考虑最佳的抗原呈递策略。本文介绍了噬菌体展示抗体筛选过程中四种抗原呈递策略，包括：直接包被，间接包被，细胞呈递和脂质体、纳米磷脂盘与VLPs呈递，以期能为大家在采用噬菌体展示技术进行抗体发现过程中提供参考和借鉴。
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