仁域生物
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纳米抗体人源化
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人源框架, 互补决定区移植, 结构模型, 回复突变
introduction
前言
本文描述了一种用于骆驼VHH序列人源化的简化方案，从人体框架选择和互补决定区移植策略，到回复突变优先级的经验评分，进行分步说明、提供模板示例和生物信息学资源，以帮助进行人源化过程。
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纳米抗体和人源化
目前，约 41% 已获批的治疗性抗体和抗体偶联药物是人源化的，其中14% 是嵌合的，只有 4% 是完全鼠源化的。转基因小鼠、单 B 细胞分选以及噬菌体、酵母或哺乳动物展示等替代抗体发现技术的开发，使得约38%的已获批抗体具有全人源序列。
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纳米抗体
单域抗体 (sdAbs)，也称为纳米抗体，与传统的单克隆抗体相比，它具有许多优势，包括能够接近隐藏和凹型表位 、高稳定性、高模块化和更小的尺寸，因此可能具有更出色的疗效、药代动力学和可开发性。sdAbs 的动物来源主要是骆驼科动物（羊驼、美洲驼和单峰骆驼）和软骨鱼（鲨鱼），它们产生不含轻链的纯重链同型抗原，并且抗原结合仅由一个可变结构域介导。这些可变域称为 VHH（骆驼科动物）和 VNAR（鲨鱼），需要人源化才能运用于人体。
骆驼科动物物种通常更容易处理和获取，在免疫后产生更强的HCAb反应，并产生与人类IGHV基因具有相对较高同源性的免疫球蛋白，因此VHH作为生物药物比VNAR优势更大。
图 1. 传统脊椎动物四聚体 IgG1、骆驼科动物仅重链 IgG 和鲨鱼 IgNAR 的结构域。每个抗体分子的可变结构域以黄色显示，抗原结合位点以红色框表示。三种类型抗体的结构模型如下所示，显示了近似互补位直径和抗原结合位点之间的距离。
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人源化
通过人源化，大部分抗体结构被对应的人源结构所取代。
第一种方法称为嵌合，通过用功能相同的人 IgG 同型恒定区，替换鼠 IgG 抗体的重链和轻链恒定区而产生的。嵌合可将 mAb 的非人源含量降低约33%。
人源化通常还指用人序列替换源抗体的重链和轻链的大部分可变结构域，使其非人含量仅为5%。在可变结构域的人源化过程中，为了保持抗原结合，保留了源抗体的互补决定区(CDR)，框架区 (FR) 在 CDR 移植的过程中被人类 FR 取代。临床数据表明，抗体人源化显著降低了人类抗抗体反应的发生率。
表 1. 人源化纳米抗体总结
MUC1，粘蛋白1；SA，血清白蛋白；VSG，变异表面糖蛋白。
NO.2
M79人源化标准protocol
以结合血清白蛋白的骆驼VHH序列M79为例，展示从骆驼科动物 VHH 结构域序列开始的 sdAb 人源化的标准protocol。
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CDR 和 FR 的划分
首先确定待人源化的骆驼 VHH 和人类 VH 模板的 CDR 和 FR 序列。图 1b 中显示了 VHH M79 和人类 VH 模板之间的序列比对，也可作为描绘其他骆驼科 VHH 进行人源化的 CDR 和 FR 片段的模型。在此步骤中，可以标记源 VHH 序列和人 VH 模板之间的四个 FR 片段中必须突变的残基（在图 1b 中用“x”表示）。
图2. 具有 100% 人源化框架的骆驼科动物 VHH 序列的生成。
(a) 从人类可变区和连接种系区组装人类 VH 模板。高变CDR3中的插入氨基酸残基任意显示为“X”。
(b) 在源骆驼科动物 VHH M79 和人类 VH 模板之间的序列比对上描绘 CDR 和 FR 片段。CDR环根据Kabat对CDR2和CDR3进行定义，并且根据Kabat和Chothia对CDR1的定义的联合进行定义。骆驼科动物和人类 FR 之间的突变位置在序列下用“x”标识。Kabat 编号显示在序列比对上方。
(c) 通过组合源骆驼科动物 VHH 的 CDR 片段和人 VH 模板的 FR 片段来组装人源化 VHH 序列。
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CDR 移植到人FR 中
下一步是将骆驼源 VHH 序列的三个 CDR 片段以适当的顺序“缝合”到人类 VH 模板的四个 FR 片段中，如图 1c 所示，且它遵循先前构建的序列比对（图 1b）。生成（100%）全人源VHH的氨基酸序列，其中整个FR是人源的，CDR是骆驼源的。
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反向突变突变体的设计
在上一步中产生的100%人源化 VHH 突变体相对于亲本 VHH 可能具较弱的抗原结合亲和力，其程度取决于特定的抗体。为了解决这个潜在问题，提出了一种设计替代人源化序列的简单程序，减轻抗原结合亲和力的损失。该过程通常包括引入“回复突变”，即源抗体框架中的氨基酸残基，可能直接或间接影响抗原结合。通用标准化模板用来帮助对具有潜在问题的位置进行反映和排序，并指导在100%人源化突变体中引入回复突变。此步骤仅提取少量人源化突变体进行重组生产和测试，在人源化程度和保留抗原结合之间找到最佳平衡。
3.1突变位置的绘制和排序
图3a提供了一个模板，可用于对任何人源化VHH序列进行评分和排序：（a）用用户的人源化序列替换所示的人源化序列，（b）确保FR和CDR边界正确匹配，以及（ c) 更新相对于源抗体序列的突变位置。
图 3. 用于确定100%人源化VHH序列的各个FR并协助回复突变的选择和优先级排序的代表性模板。
(a) 沿着人源化序列计算的回复突变得分 (BM-Score)。表2中描述的用于计算BM评分的属性在人源化序列上方标出。骆驼科动物和人类 FR 之间的突变位置在人源化序列下方用“x”标识。
(b) 在骆驼源 VHH 的 3D 同源模型上映射 BM-Score > 0 的位置，其显示为带状图，其中 CDR 环为棕色，FR 片段为灰色。面板 (a) 中确定的 BM-Score > 0 的位置呈现为以 Cα 原子为中心的球体，以蓝色色调进行颜色编码，从深蓝色显示的最高值到浅蓝色显示的最低值。BM-Score > 1 的位置由 Kabat 编号标记，而 BM-Score 1/4 1 的位置为清晰起见未标记
表2. 回复突变序列位置评分系统
3.2 使用结构信息的同源模型
使用重链的骆驼 VHH 序列输入运行 ABodyBuilder 网络服务器将生成 VHH 结构的 3D 同源模型，可以下载该模型以在本地计算机上进行目视检查和几何测量。
3.3 反向突变序列的增量生成
表3显示了逐渐添加反向突变的参考顺序，图4显示了 M79 VHH 的突变体结果示例。使用这种方法生成的人源化突变体的人源化程度会降低，随着更多回复突变的积累，丧失亲和力的风险也会降低。
表 3. 人源化突变体中增加回复突变的建议顺序
图 4. 一组人源化突变体的示例，其回复突变位置为骆驼科动物源VHH。具有100% 人源FR 的人源化 v0 突变体具有与图3中所示相同的序列。人源化突变体 v1 至 v5 按照计算的 BM-Score 值和表3中提供的指南逐步引入回复突变。由蓝色箭头表示（深蓝色—第一优先级；浅蓝色—最后优先级）
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sdAb 人源化的替代方案
由于 sdAb 人源化的复杂性和不同的成功率，有时需要多次尝试和工程步骤，因此已经开发了几种策略来完全规避人源化的需要，这些技术分为三类：
(a) 使用人源化或完全人源 sdAb 支架构建的合成 sdAb 文库，
(b) 尝试将 VHH 分离偏向具有 VH 样序列特征的稀有分子，
(c)产生具有完全人类可变结构域的 HCAb 的转基因动物。
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合成人源化 VHH 文库
Mooutel 等人描述了人源化 VHH NaLi-H1 的合成噬菌体展示文库。为了构建文库，针对细胞内表达和稳定性进行了优化的共有 VHH (hs2dAb) 在 FR1-3 的多个位置进行了部分人源化，以模拟人 IGHV3 序列。在另一项研究中，Crepin 等人从 NaLi-H1 文库中分离出五种人源化卵泡刺激素受体 VHH 抑制剂。VHH 的二聚体、Fc 融合版本是在表达功能形式的巯基氧化酶和 DsbC 的大肠杆菌细胞中产生的。遗憾的是，在所有三项研究中，都缺乏人源化 VHH 的生物物理属性的数据，例如表达产量、溶解度、稳定性和聚集抗性。
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合成全人源 VH/VL 文库
第一个被批准用于临床的全人类治疗性抗体，抗肿瘤坏死因子-a IgG1 阿达木单抗，是通过噬菌体展示分离出来的。构建一个文库，通过基因工程丝状噬菌体展示人类免疫或天然抗体库。然后针对特定抗原在重复的淘选中筛选文库以选择结合物。
Conclude
结语
本文的protocol聚焦于骆驼科动物 VHH 的人源化，其具备多样的改造可能，广受研究者青睐，目前正处于后期临床试验阶段。类似于常用的人源化框架移植法，VHH 人源化protocol进一步简化了该技术，提出了人源框架选择、CDR 移植策略的方法，为突变 FR 位置的经验评分，以确定回复突变的优先级。
注：以上图片均来自参考文献。
如需完整protocol，请联系我们！
关于仁域生物
成都仁域生物专注全人源抗体和纳米抗体发现技术，截至2024年累计建成了超万亿级全人源scFv抗体库、1800+天然野生骆驼PBMC来源的超万亿级天然骆驼纳米抗体库（VHH），并拥有现代化骆驼/羊驼养殖免疫基地，提供14天、0预付、100%成功率的优质候选抗体开发服务。
我们为您提供：全人源抗体定制；纳米抗体定制；羊驼骆驼免疫；抗体库定制等技术服务。
参考文献
Sulea T. Humanization of Camelid Single-Domain Antibodies. Methods Mol Biol. 2022;2446:299-312. doi: 10.1007/978-1-0716-2075-5_14. PMID: 35157279.
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van Faassen H, Ryan S, Henry KA, Raphael S, Yang
Q, Rossotti MA, Brunette E, Jiang S, Haqqani AS,
Sulea T et al. (2020) Serum albumin-binding VHHs
with variable pH sensitivities enable tailored half-life
extension of biologics. FASEB J 34, 8155–8171.
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合肥科生景肽生物科技有限公司成立于2018年，目前已经打造了全球领先的以肽为核心的生命分子发现、合成生产、结构优化、递送平台，主要瞄准肽发现及靶向递送，专注于为各大制药企业、生物技术公司、科研单位提供一站式的定制化研发服务。 公司独有的KPDS™平台(KS-V Peptide Discovery Services Platform)是国际领先的的多肽药物发现平台，我们致力于创新药物的高效和精准开发，以科生景肽专有KPDS技术为核心，提供一站式，定制化的多肽发现服务，以灵活的产品形式和服务模式助力广大客户各类药物发现项目的快速推进和应用探究，包括但并不限于疾病诊断及保健功能产品、多肽药物、核素偶联药物(RDC)、基于小分子的肽药物偶联物（PDC)和多功能肽偶联物等。中文官网地址：https://www.ks-vpeptide.com.cn/
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