什么是单克隆抗体？-Hypeptide

单克隆抗体（单抗，mAb）是识别一种抗原表位的同源抗体。20世纪70年代，Kohler和Milstein开发出杂交瘤技术，并产生了第一批单抗。由于单抗具有特异性、均一性和可量产，从而成为疾病治疗和诊断等多个重要应用领域的有用工具。

治疗用单克隆抗体

单克隆抗体是癌症和感染等多种疾病最常用的免疫疗法药物。免疫疗法中单抗能够与特定蛋白质或细胞特异性结合，从而增强免疫系统对病变细胞的清除能力。Muromonab是首个获得FDA批准的单抗药物，可与人T细胞表面CD3受体特异性结合，用于预防器官移植患者T细胞介导的急性免疫排斥反应。迄今为止，FDA已经批准了100种泛靶点的单抗药物，如PD1/PDL1、HER2和EGFR。为治疗临床上不同疾病，除了典型单抗外，还可研发出不同形式的单抗（例如抗体-药物偶联物、双特异性抗体、单抗片段等，见图1)。不同形式的单抗药物在治疗中的作用方式也各异。经典的单抗通常与抗原（即病原体或抗原呈递细胞）结合来触发免疫应答，进而破坏病原体或细胞。工程化单抗，比如偶联小分子药物或放射性元素的单抗，可以将这些药物或元素靶向递送至癌细胞，就像内置了“特洛伊木马”一样。而另一类工程化的单抗，即双特异性抗体，可同时靶向两种细胞受体，如其中一个结合癌细胞，另一个“桥联”并激活细胞毒性T淋巴细胞，从而达到消灭癌细胞的目的。

图1.单克隆抗体类型。

诊断用单克隆抗体

体外诊断试剂（IVD）是检测疾病和指导治疗最常用的工具之一。作为IVD检测技术之一的免疫诊断技术（图2），是利用单抗特异性结合目标抗原，再进行显色反应，以检测病原体、细胞因子或其他物质。酶联免疫吸附试验（ELISA）是最常用的免疫诊断技术。通过ELISA，技术人员可以筛查并定量血液和体液等液体样本中的目标抗原。ELISA有多种类型，常用的是直接法ELISA，将待检抗原固定在固相载体表面，加入偶联报告酶或荧光染料的单抗，再加入底物（通常是显色底物），从而产生可检测信号。免疫组织化学法（IHC）主要用于组织切片检查，对癌症或传染病进行病理学诊断。在IHC中，酶免疫连接或荧光染料标记的单抗与靶抗原结合，触发底物相关反应，从而在显微镜下观察到组织切片中的靶抗原及其分布情况。例如利用乳腺癌生物标志物（如活检组织切片中的HER2受体蛋白）对应的单抗，通过IHC进行疑似乳腺癌病例的确诊。流式细胞术是一种基于激光的流体技术，用于测量细胞或细胞微粒的生化和物理性质。最近，流式细胞术已用于病毒检测，在临床诊断中，常规的流式细胞术是将悬浮细胞注入流式细胞仪，细胞经由鞘液管进入流动室，排成单列的细胞，与入射激光相交，发生反射和折射，由检测器记录光信号。荧光染料偶联抗体常用于“染色”细胞，以检测表面生物标志物或受体。抗体结合到细胞表面时，与抗体偶联的荧光染料基于激光产生的特定激发波长发光。流式细胞术常用于诊断多种疾病，尤其是与血液相关的癌症，如白血病和淋巴瘤。除确认病原体或癌症标志物外，流式细胞术的结果是评估疾病相对负担的重要指标，也是表征免疫系统细胞数目的极佳方法。侧向层析和表面等离子共振等技术也用于临床诊断，但不如上述几种方法常用。无论何种免疫诊断，使用高亲和力和高特异性的单抗，是开发稳定性好且重现性高的免疫诊断方法的关键。

图2 常见的免疫诊断方法

如何生产单克隆抗体

有多种方法用于单抗生产，常用的是杂交瘤技术。首先，向动物体内注射特定抗原，诱导免疫应答（图3）。然后从动物体内分离出分泌抗体的单个B细胞，再将其与骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤细胞系。B细胞可产生特定抗体但寿命有限，骨髓瘤细胞可无限增殖，两者融合后获得的杂交瘤细胞就可持续地产生单一抗体。

图3 杂交瘤技术产生单克隆抗体的过程然而，也可使用植物和其他哺乳动物系统。与这些系统不同，永生化B细胞（杂交瘤）具有单抗的“构建图纸”（基因）。因此，用其他细胞表达抗体时，需要转染携带免疫球蛋白基因（轻链和重链基因）cDNA序列的两种构建体（质粒）。由植物或哺乳动物细胞产生的合成抗体称为重组抗体（rAb）（图4）。大多数表达rAb的哺乳动物系统均采用以下两种细胞系：中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系和人上皮肾（HEK）293细胞系。

图4.哺乳动物细胞系生产重组单抗

如何发现和开发单克隆抗体？

发现靶蛋白抗体的方法通常是：将这种靶蛋白和一种佐剂接种于动物，诱导动物体内产生自然免疫应答，再提取各种活性抗体，进行生物信息分析以用于进一步研究。然后，用不同方法筛选出适合研究、医疗或商业目的的最佳抗体（图5）。其中，最主要的方法有杂交瘤技术、单个B细胞测序和噬菌体体外展示技术等。传统的抗体发现方法杂交瘤技术：将含有浆细胞的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，使其永生化，建立可长期产生抗体的细胞系。单个B细胞测序：对分离的外周血单核细胞进行分选后，再用测序技术对单个B淋巴细胞的DNA或RNA进行测序，获得免疫球蛋白（Ig）基因，再在哺乳动物细胞系（如CHO细胞或HEK 293T细胞）中进行重组抗体表达。噬菌体展示或其他展示技术（细菌、酵母）：通过基因工程技术，将编码外源多肽和蛋白质的基因片段插入到噬菌体基因中，使其表达于噬菌体的表面。同时仍保持噬菌体原有的生物学活性和结构功能。之后，用特定蛋白的培养板从文库中捕捉能特异性结合靶蛋白的噬菌体，洗去未能结合的噬菌体，继而将与靶蛋白结合的噬菌体洗脱下来，用于感染细胞宿主（通常为大肠杆菌），并对其进行孵育和扩增，经过3-5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，便可实现对特异性结合靶蛋白的噬菌体的富集，从而获得能够识别靶分子的化合物。

抗体蛋白测序：发现抗体的补充方法

快序生物提供的抗体发现服务，是基于质谱技术和大数据驱动的机器学习，该技术也可直接用于免疫动物亲和纯化后的血液分析，可从接种目标抗原的动物血液中发现抗体，而无需处死动物。对于较简单的样本，例如经过多次纯化后可视为单克隆或双克隆抗体的样本，我们还提供单抗测序服务，而我们的客户已成功利用这种方法开发出多种治疗用途的抗体和研究用途的抗体。

图5.抗体发现的各种技术参考文献

1.Singh, S. et al. Monoclonal Antibodies: A Review. Curr Clin Pharmacol 13, 85-99, doi:10.2174/1574884712666170809124728 (2018).

2.Mullard, A. FDA approves 100th monoclonal antibody product. Nat Rev Drug Discov 20, 491-495, doi:10.1038/d41573-021-00079-7 (2021).

3.Arruebo, M., Valladares, M. & González-Fernández, Á. Antibody-Conjugated Nanoparticles for Biomedical Applications. Journal of Nanomaterials 2009, 1-24, doi:10.1155/2009/439389 (2009).

4.Jazayeri, M. H., Amani, H., Pourfatollah, A. A., Pazoki-Toroudi, H. & Sedighimoghaddam, B. Various methods of gold nanoparticles (GNPs) conjugation to antibodies. Sensing and Bio-Sensing Research 9, 17-22, doi:10.1016/j.sbsr.2016.04.002 (2016).

5.Lu, R. M. et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. J Biomed Sci 27, 1, doi:10.1186/s12929-019-0592-z (2020).

6.Gao, Y., Huang, X., Zhu, Y. & Lv, Z. A brief review of monoclonal antibody technology and its representative applications in immunoassays. J Immunoassay Immunochem 39, 351-364, doi:10.1080/15321819.2018.1515775 (2018).

关于快序上海快序生物科技有限公司拥有全球领先的蛋白质从头测序技术，致力于该技术在医药领域的应用。通过此技术可以对免疫系统产生的抗体蛋白组进行全面检测，从而实现对包括自身免疫病、癌症和感染在内的多种疾病的跟踪和预警。同时，在新抗体和药物研发领域，公司的技术也提供了全新的抗体发现平台，可以直接从免疫动物或者人血清中测得新的单克隆抗体，大大缩短了新抗体研发的周期。

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