噬菌体是一类以细菌、真菌、放线菌等微生物为寄主的病毒，存在于多数原核生物中，主要由蛋白质和核酸组成。在繁殖时，噬菌体会将遗传物质注入宿主菌，后者会产生噬菌体的遗传物质和胶囊蛋白，并装配成新的噬菌体，从而完成整个繁衍过程。目前，已有近2900种噬菌体可通过电镜观察到，其中，以大肠杆菌为宿主的噬菌体研究最为深入。
基于这神奇的噬菌体，1985年Smith开发了噬菌体展示技术并在合成生物学领域开始悄然发力；由于噬菌体展示技术成熟的研究体系、成本低、操作简单等特点，该技术受到研究者的广泛关注，更是于2018年获得了诺贝尔化学奖，成功出圈！
噬菌体展示技术
发展历程
2018年，噬菌体展示技术和酶的定向进化技术一起被授予诺贝尔化学奖，在生物合成学领域引起轰动。其中，噬菌体展示技术经过三十几年的发展，走进了大众的视野，成为当仁不让的“爆款”技术，引发广泛讨论。
早在1983年，Renato便提出了通过噬菌体表面展示外源多肽的概念，此时，离噬菌体展示技术的问世仅剩两年。1985年，Smith首次将编码多肽序列的外源DNA片段插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ中，产生融合蛋白并在噬菌体表面展示，最终快速发现了与靶标特异性结合富集的多肽序列。噬菌体展示技术就此诞生。
1990年，噬菌体展示技术的研究遍地开花：Mc Cafferty等利用该技术构建了库容为106的抗体库，发展了新兴的抗体制备技术；George发现，噬菌体不会因外源DNA片段的插入而影响本身的黏附、侵入、整合功能；Scott、Cwirla和Devlin 3个研究小组几乎同时报道了用丝状噬菌体fd或M13构建随机6肽库，噬菌体展示肽库自此被广泛应用于生物工程的多种研究领域；Prof. Winter则利用该技术成功开发了第一个全人源抗体药物——“药王”阿达木单抗，噬菌体展示技术真正走入医药研发领域。此外，Prof. Winter还打开了利用化学修饰手段构建噬菌体展示特定环肽库的大门，启发了无数学者。
1996年，Dr. Pasqualini将噬菌体展示的多肽文库从尾静脉注射到小鼠体内，成功筛选出靶向肿瘤/特定器官的多肽。由于是在动物体内进行，该方法又被称为体内噬菌体展示技术。
技术原理
噬菌体展示技术本质上是一种筛选技术，通过将不同的外源DNA序列插入噬菌体的外壳蛋白基因中，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，外源基因与噬菌体外壳蛋白融合，并通过子代噬菌体的重新组装展现在其表面，形成噬菌体展示文库。噬菌体表面的外源DNA序列仍保持独立的空间结构和生物活性。
随后，用特定蛋白的培养板从文库中捕捉能特异结合靶蛋白的噬菌体，洗去未结合靶标蛋白的噬菌体，继而用酸碱或者竞争的分子将与靶点结合的噬菌体洗脱下来，用于感染细胞宿主(通常为大肠杆菌)，并对其进行孵育和扩增。如此循环往复，经过3~5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，便可高度富集能特异性结合靶蛋白的噬菌体，最终获得能识别靶分子的化合物。
系统分类
噬菌体展示技术有多种分类标准，可根据噬菌体(Phage)、载体(Vetor)和文库(Library)的不同进行分类。其中，根据噬菌体的不同，可以分为T4、T7、λ、M13等多种体系，本文中，我们依据此对4种噬菌体展示系统进行比较，不同的噬菌体展示系统各有特点。
M13噬菌体展示系统
M13噬菌体中用于构建展示系统的衣壳蛋白主要为P3和P8。P3分布在噬菌体颗粒的一端，可在N端的柔性连接区插入外源多肽/蛋白，其对后者的大小无严格的要求，因此可用来展示分子量较大的蛋白；P8主要分布在噬菌体颗粒的两侧，拷贝数较多，较适合用来筛选低亲和力的配体，由于该蛋白的分量很小，P8只适合用来展示外源短肽。
T4噬菌体展示系统
T4噬菌体的显著特点是能将两种性质完全不同的外源多肽/蛋白，分别通过与其衣壳蛋白上的SOC位点和HOC位点融合，以同时展示与T4噬菌体的表面，展示的拷贝数也较多。同时，其病毒颗粒是在宿主细胞内组装的，无需通过分泌途径，因此可展示的多肽/蛋白的范围极广，尤其适用于研究那些不能被大肠杆菌分泌的复杂蛋白质。
T7噬菌体展示系统
T7噬菌体是于1990s末期建立的一种新型噬菌体展示技术，其衣壳蛋白上的10B蛋白常被用来构建噬菌体展示系统。与M13相比，其无需经过分泌，可直接使宿主菌进行裂解。因此可用于展示对分泌过程有抑制作用的多肽/蛋白，后者无法很好地展示于M13系统；此外，T7噬菌体的生产十分迅速，可节省大量时间，便于研究。
λ噬菌体展示系统
λ噬菌体是长尾噬菌体科的一种温和噬菌体，其头部由D蛋白和PV蛋白构成，可用于构建噬菌体展示系统。λ噬菌体的装配在宿主细胞内完成，无需将外源多肽/蛋白分泌到细菌胞膜外，因此可展示有活性的大分子蛋白及宿主细胞有毒性的蛋白质，适用范围极广。
总体而言，不同的噬菌体展示系统各有其特点：如M13噬菌体可同时展示分子量较大的蛋白或外源短肽；T4噬菌体可用于研究大肠杆菌无法分泌的复杂蛋白；T7噬菌体可用于无法通过M13噬菌体良好展示的多肽/蛋白；λ噬菌体则适用于有毒性的蛋白展示等。随着研究进一步深入，噬菌体展示技术在多肽和抗体等领域的应用越来越广泛，未来有潜力登上更大的舞台。
噬菌体展示技术应用——多肽
由于噬菌体肽库能展示大量不同蛋白肽模拟真实表位，噬菌体展示技术在多肽领域发挥着重要作用，通过该技术已成功研发了一些多肽类药物。其中，已上市的多肽类药物包括Amegen的特发性血小板减少性紫癜治疗药物——Romiplostim(商品名为Nplate®)；Affymax的抗贫血药物——Peginesatide(商品名为Omontys®，由于副反应而撤市)；Dyax的Ecallantide (Kalbitor®)等。
通过噬菌体展示技术制备多肽的原理通常为：通过将随机肽段插入到噬菌体衣壳蛋白上形成融合蛋白进行展示，并利用噬菌体能大量复制的特点，得到不同重组噬菌体的多拷贝，组建多样性噬菌体展示肽库。其中，肽段的基因序列既可来自化学合成寡聚核苷酸链的降解，也可来自某个抗体或病毒基因组全部序列的随机插入。
目前，噬菌体展示肽库已由最初的6肽、7肽发展到38肽、40肽，库容越大，越有利于多样性筛选，扩大药物发现和研究的范围。
Romiplostim
罗米司亭(Romiplostim)是由噬菌体展示技术筛选出的肽段，连接至Fc片段形成的肽融合蛋白(肽体),它含有两个相同的单链亚基，每个亚基中的IgG1 Fc载体结合域与血小板生成素受体(c-Mpl)相互作用，以刺激内源性血小板生成素的生成。
罗米司亭由美国Amgen和日本协和发酵麒麟共同研发而成，2008-08-22，继在澳大利亚上市，罗米司亭获FDA批准上市(商品名为Nplate®)，成为首个血小板生成药物，用于治疗血小板减少性紫癜。
2012-2020年，Nplate®的市场表现良好。2013年，Nplate®的销售额为$368Mn，占Amgen营收的2.13%；2013-2020年，Nplate®销售额以11%的CAGR增长，2020年，Nplate®销售额达$850Mn，为2013年的2.3倍，对Amgen总营收的贡献增长至3.34%。
Ecanllantide
Ecanllantide是一种重组激肽释放酶蛋白抑制剂，通过噬菌体展示技术，从以Kunitz结构域肽(能以不同的强度抑制大量丝氨酸蛋白酶)构建的噬菌体展示文库中被发现。Ecanllantide由60个氨基酸组成，可选择性可逆地抑制血浆激肽释放酶的活性，原研厂家为Dyax。Kalbitor®的发现得益于Dyax专有的噬菌体展示技术，该技术可快速筛选与治疗靶标具有高亲和力和特异性的化合物，Dyax旗下的肽库和抗体库均包含数十亿种候选分子。
2009-11-27，Ecanllantide(商品名为Kalbitor®)获FDA批准上市，用于治疗遗传性血管性水肿(HAE)，成为Cinryze®的重要对手。Cinryze®是一款血源性C1-酯酶抑制剂，于2008年获批上市，为第一款遗传性血管水肿疗法，但仅一年后，Kalbitor®就问世，与Cinryze®竞争。2016-01，Shire完成对Dyax的收购，而前者又于2019年被Takeda收购。
噬菌体展示技术应用——抗体
噬菌体展示技术为全人源重组抗体提供了一条简便快捷的基因工程抗体制备路线：用PCR技术从人体免疫细胞中扩增出整套的抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因，以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面。此时的噬菌体DNA中既有抗体基因的存在，又有抗体分子的表达，可利用抗原-抗体特异性结合来进行筛选，并进行克隆扩增。将VH和VL随机组合便可建成组合抗体文库；若抗体mRNA来源于未经免疫的正常人，则可在无需细胞融合的情况下建立起人天然抗体库，后者中的抗体可避免人体发生免疫反应。
通过噬菌体展示技术可筛选各类型抗体，包括一般抗原的特异性抗体，非免疫原性/毒性抗原的抗体、有识别功能的人抗体如scFv、Fab、双功能抗体，及三价、四价抗体等。得到的抗体通过工程改造可转变成其他形式，如小分子抗体、免疫毒素、靶向细胞因子等，应用十分广泛；其中，相较于通过免疫动物生成的单抗，利用该技术生成的单抗，具有高效率、快生产、操作简便等优势，利用价值高。
Adalimumab
阿达木单抗(Adalimumab)是由噬菌体展示技术研发的第一个全人源重组IgG1-κ单抗，也是首个获批的抗肿瘤坏死因子TNFα药物，用于治疗类风湿性关节炎。阿达木单抗通过噬菌体展示技术的“指导选择”筛选而得。该步骤分为两步：首先，研究人员开发了鼠源抗人类TNF抗体MAK195，利用该抗体指导分离与MAK195有相同表位的人源抗体；其次，在蛋白库中找到与AMK195配对的人类DNA序列，并利用噬菌体展示技术进一步筛选，从而得出高亲和性的抗TNF抗体，即阿达木单抗。
2002-12-31，阿达木单抗获FDA批准上市(商品名为Humira®)，就此成为AbbVie的当家产品。目前，Humira®在全球已获批超过17个适应症，包括类风湿关节炎、强直性脊柱炎、银屑病等医疗需求大的慢性病；2021-02，Humira®获批用于治疗5岁以上儿童患者中重度活动性溃疡性结肠炎的新适应症。2019年以前，Humira®全球销售额不断攀升，在2005年和2013年分别突破$1Bn和$10Bn大关。2012-2020年，Humira®连续8年荣登全球药品销售榜榜首，其中，Humira®更是以近$20Bn的销售额在2018年创造了史上药品年销售额的新纪录，成为当之无愧的全球药王。2012年起，由于AbbVie从Abbott中拆分出来，总销售额发生变化，致使Humira®在总销售额中的占比从2011年的20.3%一跃至50.4%，2020年以前一直保持在50%以上的高位。
Humira®已于2018-10-16在欧洲地区失去专利保护，面临多款生物类似药的竞争；为了保护Humira®这棵常青树，AbbVie煞费苦心，通过不断申请不同类型的专利，延长专利保护期。截至2018年，Humira®在欧美日共申请专利386件，其在美国的市场独占期将于2023-01结束。
Belimumab
贝利木单抗(Belimumab)是一种人源IgG1λ单抗，由Cambridge Antibody Technology(CAT)与Human Genome Sciences(HSG)共同研发，可特异性结合可溶性B细胞刺激因子(BLyS)，阻止BLyS与B细胞结合，促进B细胞凋亡。贝利木单抗的发现得益于噬菌体文库技术和高通量测序技术的结合。CAT通过噬菌体文库筛选出与人BlyS结合的单链可变片段(scFv)，筛选出1200个抗体；HSG利用其高通量测序技术来确定每个抗体重链和轻链的序列，最终在2003年得到了亲和力较高的贝利木单抗。
2011年，贝利木单抗获FDA批准上市(商品名为Benlysta®)，用于治疗系统性红斑狼疮(SLE)，是近50多年来首个SLE治疗药物。2012-08，GSK完成对HSG的收购，并将Benlysta®收入了囊中。
2013-2020年，Benlysta®的销售额和销售额占比逐年攀升。2013年，Benlysta®的销售额和销售额占比仅分别为￡146Mn和0.55%，2020年，Benlysta®销售额达￡719Mn，销售额占比提高至2.11%，分别为2013年的4.92倍和3.8倍，销售额CAGR为25.6%。Benlysta®在欧洲地区的专利将于今年到期；在美国的专利将于2023年到期，随着竞争者的不断涌入，GSK致力于拓展Benlysta®在狼疮性肾炎(LN)的适应症，而Benlysta®也不负众望，于2020-12获FDA批准，成为第一款LN成人治疗药物。随着LN新适应症的获批，Benlysta®成为了有且仅有的、同时获批用于治疗SLE和LN的药物，有望成为GSK的重磅药物。
明星企业
随着噬菌体展示技术的流行，一些Biotech企业纷纷搭建起了专有的噬菌体展示技术平台，如Bicycle和MorphoSys等专注于自主开发的专有技术及平台，保持自己的竞争优势，且凭实力与Eli Lilly、AstraZeneca等企业开展合作；而Big Pharma也通过收购的方式将该技术收入麾下，如Shire收购Dyax；AstraZeneca收购CAT等。
Bicycle
Bicycle Therapeutics是一家以双环多肽产品(Bicycle®)为基础的创新药研发公司，主要研究多肽偶联药物(PDC)。公司具有专有的噬菌体筛选平台Bicycle®，该平台是基于Greg Winter和Christian Heinis在环肽展示方面的开创性成果，二人于2009年在《Nature Chemical Biology》上首次发表了利用噬菌体展示技术筛选环状多肽的方法：将含3个半胱氨酸的肽段插入M13噬菌体的P3蛋白融合，使其在噬菌体表面展示；展示的多肽为线性肽，Greg Winter在此基础上添加了环化步骤，使多肽内形成3对链内二硫键，从而形成双环，构建了环肽库。最后，通过特定蛋白从构建的环肽库中筛选出高亲和力的靶向肽。
Bicycle在工程噬菌体的表面上展示了大量多样的线性肽，并通过Winter教授的环化技术将多肽设计成环肽Bicycle®——由短的线形肽在“支架”的作用下形成具有两个环的短肽(9~15个氨基酸组成)，这些短的双环肽具有良好的组织渗透率和肾脏清除率、高度亲和力和选择性等优点，结合了生物药的药理学和小分子药物的药动学的优势，没有免疫原性。Bicycle在改造后的分子上挑选多个氨基酸位点，分别插入赖氨酸作为连接位点，同时使用不同长度的二价、三价和四价PEG连接子，构建二聚环、三聚环肽和四聚环肽，组合超过60个。
目前，Bicycle有三款在研多肽偶联药物，均为Bicycle®肽：BT1718、BT5528和BT8009，均用于治疗癌症，其中BT1718和BT5528处于临床Ⅱ期；BT5528和BT8009处于临床Ⅰ期。此外，在免疫肿瘤学领域，公司的主要在研药物有BT7480、BT7455和BT7401等，其中，BT7480和BT7455正在申请IND，BT7401处于临床前研究阶段。Bicycle Therapeutics与多方厂家和机构合作共同开发，如Genentech、AstraZeneca、Ionis等。
MorphoSys
MorphoSys是一家致力于开发人源化抗体药物的生物技术公司，拥有多项核心技术，包括HuCAL®在内的人源化重组抗体库，及CysDisplay®技术——一种新颖且有效的展示方法。其中，HuCAL®是有史以来最强大的合成抗体库之一。
HuCAL®是MorphoSys构建的第一代人源重组抗体库，可在体外生成高度特异性的全人类抗体。MorphoSys选定了7个重链可变区框架(VH1A,VH1B, VH2,VH3,VH4,VH5,VH6)和7个轻链可变区框架(VK1,VK2,VK3, VK4, VL1, VL2, VL3)，通过MorphoSys专有的TRIM技术分别在其CDRs中引入突变后，组合构建了49种不同的单链抗体库(scFv)，库容量达2*1010。MorphoSys分别于2007年和2011年推出了升级版抗体库：HuCAL GOLD®和HuCAL PLATINUM®，库容量分别为1.6*1011和4.5*1011。
CysDisplay®技术是一种新颖且有效的噬菌体展示方法，其特点是通过可切割的二硫键将抗体片段在丝状噬菌体表面进行展示：含编码抗体的目标宿主(如大肠杆菌)同时表达Fab抗体片段和噬菌体外壳蛋白，二者均包含一个未配对的半胱氨酸残基，在被辅助噬菌体感染后，未配对的半胱氨酸残基形成二硫键，并被整合到噬菌体颗粒中，从而在噬菌体表面展示相应的功能抗体片段。同时，由于抗体片段的二硫键对还原剂敏感，可使用有效的洗脱方案来促进特异性高亲和力噬菌体的洗脱，从而防止高亲和力抗体在选择过程中丢失，这也是传统噬菌体展示方法面临的问题。
利用三个全合成抗体库和CysDisplay®技术，Morphosys开展了各种单抗定制服务和治疗单抗研发。
2012-12，MorphoSys宣布将其诊断和研究用抗体研究部门(AbD Serotec)出售给Bio-RAD，与此次交易共同进行的还有HuCAL®抗体库技术的授权。目前，AbD Secotec作为Bio-RAD的子公司，是目前唯一一个可利用HuCAL®抗体库技术进行单抗定制的服务商。
目前除了探索已上市药物Monjuvi®的其它适应症外，MorphoSys的pipeline中还包括MOR202(Felzartamab)，后者是一种靶向CD38的治疗性人源单抗，源自MorphoSys的HuCAL®抗体库，目前处于治疗多发性骨髓瘤的Ⅲ期临床阶段和抗PLA2R抗体阳性膜性肾病的Ⅱ期临床阶段。
噬菌体展示技术的出现和应用离不开科学的进步与技术的革新，短短几十年里，由问世到取得诺贝尔奖的桂冠，噬菌体展示技术为科学界带来了不少惊喜。未来，噬菌体展示技术又将如何惊艳四方，着实令人期待。
合肥科生景肽生物科技有限公司成立于2018年，目前已经打造了全球领先的以肽为核心的生命分子发现、合成生产、结构优化、递送平台，主要瞄准肽发现及靶向递送，专注于为各大制药企业、生物技术公司、科研单位提供一站式的定制化研发服务。 公司独有的KPDS™平台(KS-V Peptide Discovery Services Platform)是国际领先的的多肽药物发现平台，我们致力于创新药物的高效和精准开发，以科生景肽专有KPDS技术为核心，提供一站式，定制化的多肽发现服务，以灵活的产品形式和服务模式助力广大客户各类药物发现项目的快速推进和应用探究，包括但并不限于疾病诊断及保健功能产品、多肽药物、核素偶联药物(RDC)、基于小分子的肽药物偶联物（PDC)和多功能肽偶联物等。 中文官网地址：https://www.ks-vpeptide.com.cn/ 英文官网地址：https://www.ks-vpeptide.com
