『i实验』是i科研公众号推出的一档全新的专栏。在这个专栏里，我们将深入浅出地为您介绍经典实验的原理和操作方法，分享实验资料，解析实验技巧，为实验小白们提供入门的指南。
2018年度诺贝尔化学奖授予了美国加州理工学院的弗朗西斯·阿诺德（Frances H. Arnold）、美国密苏里大学的乔治·史密斯（George P. Smith）以及英国剑桥MRC分子生物学实验室的格雷戈里·温特爵士（Sir Gregory P. Winter），以表彰他们 “肽类和抗体的噬菌体展示技术”的贡献。本期『i实验』，小编将带你了解噬菌体展示技术。
噬菌体展示技术（phage display）是利用基因重组的方法，将目标蛋白的基因重组到噬菌体衣壳蛋白的基因上，最终将目标蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面。
1985年Smith GP首次将外源基因插入到丝状噬菌体(Filamentous bacteriophage)的基因组中，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示到噬菌体的表面，从而创建了该项技术。噬菌体展示技术模拟了自然选择（如抗体亲和力成熟）的过程，可在短时间内实现对靶分子特异性受体的高通量筛选，同时将所筛选蛋白分子的基因型与表型完美的结合在了一起，极大地提高了筛选的效率。
噬菌体是一种以细菌作为宿主的病毒，用于噬菌体展示的噬菌体可以是M13噬菌体、T4噬菌体、λ噬菌体等，在噬菌体展示技术中应用比较广泛的是丝状噬菌体。
丝状噬菌体（Filamentous bacteriophage）是一类只能感染雄性大肠杆菌（具有鞭毛的大肠杆菌）的噬菌体，其特点为内部的DNA为单链DNA。丝状噬菌体作为展示载体的优势在于其形成子代噬菌体时，衣壳蛋白的包装过程是在DNA外溢的过程中完成的，因此，以丝状噬菌体作为载体时，可容纳较大长度的外源基因。
M13噬菌体属于丝状噬菌体，常见的丝状噬菌还包括fd，f1等种类，这些噬菌体内部DNA长度都是6.4kb，且具有高度同源性。M13基因组可编码10种蛋白质。在这10种蛋白质中，有5种是衣壳蛋白,其中pⅢ蛋白和pⅧ蛋白可用于外源蛋白的展示。
ｐⅧ为管状结构，是噬菌体的主要衣壳蛋白；ｐⅢ位于M13噬菌体的尾部，可通过与大肠杆菌的Ｆ菌毛结合，感染宿主菌。噬菌体结构蛋白ｐⅢ和ｐⅧ均可作为融合蛋白的一部分展示外源蛋白，区别在于：ｐⅢ蛋白的拷贝数低（3-5个），适合筛选高亲和力的配体分子，可展示分子量较大的蛋白；ｐⅧ蛋白的拷贝数比较高 （约2700个）比较适合展示分子量较小的多肽，pⅧ展示系统在疫苗开发上具有较高的应用价值。
经典的筛选方法主要包括固相筛选法和液相筛选法两种方法。
固相筛选法通常将浓度梯度降低的抗原包被在酶标板或其他固相介质上，用噬菌体文库进行多轮筛选；液相筛选法是将生物素化的抗原包被在与亲和素偶联的磁珠上，再用噬菌体库进行多轮筛选的方法。
噬菌体与抗原在实验条件下结合的过程称为孵育（incubation）。抗原抗体充分结合后，用PBST/PBS洗去非特异性及亲和力较弱的噬菌体展示抗体，再用适当的洗脱液将能与目标抗原特异性结合的抗体洗脱下来。常见的洗脱方法（eluting）包括酸洗脱法、碱洗脱法、竞争洗脱法和酶洗脱法。竞争洗脱法是用游离的高浓度的标准品进行洗脱，对半抗原的用量和纯度要求比较高，而酶洗脱法是针对TomlisonT+J文库设计的。
每轮筛选的过程都是沿着“包板→孵育→清洗→洗脱→富集”的循环进行，每一次完整的循环称为一轮淘洗（panning），淘洗通常会进行3-5轮。随着淘洗轮数的增加，筛选的条件也越来越严格。例如，用于包板的目标分子浓度会逐渐降低，清洗的次数和强度也随着淘洗轮数的增加逐渐加强。通过该种方法，最终可获得高亲和力的蛋白分子。
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噬菌体展示技术在生物医药领域中大放异彩，这不得不提“药王”——阿达木单抗。阿达木单抗（Adalimumab，商品名为修美乐）是噬菌体展示技术用于抗体筛选的成功案例。阿达木单抗是完全人源化的抗肿瘤坏死因子单克隆抗体，用于治疗类风湿性关节炎和炎症性肠病等自身免疫性疾病。目前，该药已在全球96个国家上市销售，覆盖的适用病种达到了14个，其2017年的销售额更是高达180多亿美元，是目前世界上最为畅销的药物。
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