1. 噬菌体展示概念
² 噬菌体,顾名思义,吃细菌的生物体,侵染对象是细菌的病毒,包括M13、T7、T4、λ噬菌体等,均可用于展示,最常用的当属M13噬菌体。
² 噬菌体展示技术(phage display)是通过基因工程技术将外源编码多肽或蛋白质的基因插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,使外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达,随子代噬菌体的重新组装呈现在噬菌体表面,可以保持相对的空间结构和生物活性。
2. M13噬菌体展示系统
² M13噬菌体属于单链环状DNA病毒,其基因组为6.4 kb,编码11种蛋白,其中5种为结构蛋白,包括主要衣壳蛋白的PⅧ和次要衣壳的pⅢ、pⅥ、PⅦ和PⅨ。
² pⅢ和PⅧ是噬菌体展示中最常用的两种蛋白,构建了pⅢ和PⅧ展示系统:
1)pⅢ由406个氨基酸构成,有3-5个拷贝分布在噬菌体颗粒的一端,可在N端的柔性连接区插入外源蛋白或者多肽。pⅢ系统的主要优点是对展示的外源蛋白大小无严格的要求,该系统可以用来展示分子量较大的蛋白。
2)主要衣壳蛋白PⅧ的分子量为5.2 kDa,主要分布在噬菌体颗粒的两侧,每个噬菌体大约含有2700个拷贝。由于PⅧ蛋白拷贝数较多,该系统比较适合用来筛选低亲和力的配体。由于该蛋白的分子量很小,只适合用来展示外源短肽。外源肽段的太大会影响病毒包装,不能形成有功能的噬菌体。
² 载体可分为噬菌体(phage)和噬菌粒(phagemid)载体,噬菌体载体是直接在噬菌体基因组上编辑融合蛋白,一般用于短肽(少于50个氨基酸)展示。噬菌粒载体大约等同普通质粒,包含质粒复制位点,抗性基因,多克隆位点等,区别在于噬菌粒还包含有M13 单链DNA f1 复制位点和编码M13衣壳蛋白的基因。
² 噬菌粒载体需要辅助噬菌体协助展示,根据辅助噬菌体或包含或缺失编码PIII蛋白的基因,分为单价展示和多价展示系统,它们的单链DNA f1 复制位点都是缺陷的。
² 辅助噬菌体侵染包含噬菌粒的大肠杆菌后,其注入的ssDNA基因组可以编码复制酶和衣壳蛋白等,但其缺陷的f1 ori无法与噬菌粒野生型f1 ori竞争,最终包装释放的噬菌体内核大多是phagemid,再次侵染E. coli并通过抗性筛选后,得到的基因型和表型完全一致。
3. 抗体库的构建
² 根据抗体多样性来源不同,分为天然库,免疫库,合成库和半合成库。抗体展示的形式可分为scFv和Fab。
4. 噬菌体库的淘选(Panning)
² 淘选根据抗原形式不同,可分为细胞panning和蛋白panning,蛋白可以通过生物化与SA beads结合进行液相panning,也可以将蛋白吸附在免疫管进行固相panning。
5. 单克隆的筛选(screening)
² 挑选单克隆,IPTG诱导表达scFv上清或者包装成phage,通过ELISA或FACS检测其与抗原的结合。
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