最近熊叔发现后台有同学问到噬菌体抗体库的相关实验内容，而且还不止一位同学！这不禁让我思考…是不是很多实验室开始逐渐转向抗体工程这部分，尤其是这种纳米抗体，那么既然同学们问了，我们借这个机会来讲讲这个噬菌体展示技术究竟是什么东东，话不多说，直接开始！
2018年10月30日，诺贝尔化学奖的一半奖金授予美国科学家乔治·史密斯(G. Smith)及英国科学家格雷戈里·温特尔爵士(Sir G. Winter)，以表彰他们在发明及应用噬菌体（phage）展示技术中作出的贡献。噬菌体展示技术（phage display technique）出现之后，组合抗体库很快就被取代了。所以目前一般意义上的抗体库也就是指这种由噬菌体展示技术构成的抗体库。目前噬菌体展示系统已被广泛应用于抗体工程、疫苗研发和多种疾病的诊断与治疗。
简单概括——什么是噬菌体展示技术？
就是将设计基因插入噬菌体载体上，让外源多肽或蛋白与噬菌体外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面，这样我们设计的多肽或蛋白也就跟着外壳蛋白一起展示在了噬菌体表面上。然后用靶蛋白（抗原）去一轮一轮的富集筛选识别靶蛋白的噬菌体，最后就可以得到我们想要的且亲和力高的噬菌体抗体，understand? 不understand也没事儿，跟着熊叔继续看！
原理详解——具体怎么回事？
噬菌体展示目前用到的噬菌体有：M13噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体、λ噬菌体。每种系统都有自己的优点，比如说M13噬菌体构成的pⅢ 系统对展示的外源蛋白大小无严格的要求，可以用来展示分子量较大的蛋白；T4噬菌体展示系统能够将两种性质完全不同的外源多肽或蛋白质，分别与T4衣壳表面上的外壳蛋白SOC和HOC融合而直接展示于T4噬菌体的表面，因此它表达的蛋白不需要复杂的蛋白纯化，避免了因纯化而引起的蛋白质变性和丢失。对这一部分感兴趣的同学可以自己去分别查阅一下资料，而熊叔就以应用比较广泛的是丝状噬菌体M13为例来讲解：
丝状噬菌体是一种纤丝状、单链DNA病毒颗粒，最常用包括fd, fl和M13噬菌体。这些噬菌体内部DNA长度都是6.4kb，且具有高度同源性。M13基因组可编码10种蛋白质。在这10种蛋白质中，有5种是结构蛋白——衣壳蛋白。其中，pⅢ 和PⅧ 是噬菌体展示中最常用的两种蛋白，构建了pⅢ 和PⅧ 展示系统。
所以将编码外壳蛋白的基因Ⅷ或基因Ⅲ与抗体基因融合表达，使表达的抗体附着在噬菌体表面，达到展示的目的，同时确保了抗体这一特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内，即噬菌体核心DNA中含有特定蛋白分子的结构基因，并能在噬菌体表面表达该蛋白。
那么pⅢ系统和PⅧ各有什么优缺点呢？
PⅧ蛋白分子量为5.2 kDa，主要分布在噬菌体颗粒的两侧。由于分子量很小，只适合用来展示外源短肽（小于十肽）。外源肽段太大会影响病毒包装，不能形成有功能的噬菌体。另一方面，因为PⅧ蛋白属于多拷贝白，若外源基因与基因Ⅷ融合，则会在噬菌体表面表达出多个拷贝的外源蛋白，这种多价表达有利于低亲和力配体的筛选。
pⅢ蛋白分子量为42 kDa，分布在噬菌体颗粒的一端，只有3～5个拷贝。主要优点是对展示的外源蛋白大小无严格的要求，该系统可以用来展示分子量较大的蛋白。但由于抗体在噬菌体末端的表达率仅为10%，所以表达有外源蛋白的噬菌体一般均为单价，而这种单价表达有利于高亲和力配体的筛选。
由于整个过程步骤繁多，涉及到的原理也很多，无法在一篇推文里详尽，老熊在这里先把建库过程大致勾勒一下，大家好有一个基本概念，后面熊叔看看大家的反馈，如果感兴趣的人多，我们会从建库到筛选到表达走一遍，在这个过程中，再把原理都详细地讲解出来。
噬菌体展示技术的核心步骤就是：建库和筛选
1、制备抗体基因文库
目前利用抗体库表达的抗体分子片段主要是Fab和scFv。还不了解Fab和scFv的指路，自己去恶补：
干货笔记|高分文章里出现的这么多抗体类型，你都知道是什么意思吗？
收集目标抗体宿主的免疫细胞（B淋巴细胞、致敏B淋巴细胞、非致敏B淋巴细胞等），提取总RNA，经RT-PCR分别扩增出抗体的VH和VL编码基因，纯化回收VH和VL片段，然后把VH和VL拼接在一起。
2、将抗体基因转入噬菌体
将scFv或Fab基因插入到噬菌体载体中，构建噬菌粒。
3. 侵染宿主菌
通过电转，把噬菌粒转到大肠杆菌中。噬菌粒转入宿主菌后，可在宿主菌体内自我复制，在宿主菌生长至对数生长期后，加入辅助噬菌体进行超感染，促使质粒合成单链DNA并完成噬菌体传代。
4. 获得scFv或Fab抗体库
辅助噬菌体超感染宿主菌后，噬菌体开始传代并裂解宿主菌，培养过夜离心收集上清即可获得噬菌体抗体库
5. 筛选
以靶蛋白为抗原，经过一段时间的共同孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，只留下了表达阳性抗体的噬菌体，然后以竞争受体洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体。洗脱的噬菌体感染宿主菌后经繁殖扩增。每轮筛选的过程都是沿着“包板→孵育→清洗→洗脱→富集”的循环进行，每一次完整的循环称为一轮淘洗（panning）。这样的吸附、洗脱、扩增过程，要重复进行3-5轮，即可筛选出与靶蛋白具有高亲和性且结构稳定的scFv或Fab蛋白。
6、表达
获取目的克隆进行大量表达，纯化蛋白。
我知道，看到这里小白可能有一脑袋问号：什么是噬菌粒？什么是辅助噬菌体？
建库的时候，一般用到的是噬菌粒载体来取代噬菌体，噬菌粒是一种对丝状噬菌体人工改造后的载体，兼具丝状噬菌体与质粒的特点，所以它既具有噬菌体的包装序列、复制子也包含质粒复制子、克隆位点、标记基因等部分。为什么要用噬菌粒而不直接用噬菌体？因为相比于整个噬菌体病毒，噬菌粒的基因组较小可插入较大片段、易于操作、转化效率高、产生的重组子更加稳定。
那么辅助噬菌体是啥？
辅助噬菌体是一种自身DNA复制效率极低的丝状噬菌体突变型，基因组具有M13噬菌体的所有功能基因，但IG区是缺陷的，不能被pⅡ蛋白识别，因而辅助噬菌体本身DNA不能进行单链复制。但它能为噬菌粒提供pⅡ蛋白和包装蛋白，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒可以顺利的进行DNA的复制与噬菌体的包装，完成对宿主的侵染（这一过程通常称为超染）。常用的辅助噬菌体有VCSM13和M13K07等。
所以简单来概括就是：噬菌粒+辅助噬菌体这个组合才能顺利侵染大肠杆菌。
最后再来说说噬菌体库的主要分类：
天然抗体库：
不用免疫动物。抗体均来源于人类，是完全的人源化抗体，但亲和力通常较低。所构建的抗体库适用于所有抗原所对应的抗体的选择，理论上可以用这个抗体库去筛针对任何抗原的抗体，库容量要求较高，最小需要达到10^9。但是缺点是，这些抗体基因缺乏体内重排与突变，想要获得高亲和力的抗体不容易，筛选出来的抗体需要进一步亲和力成熟改造，而且筛选背景也比较高。
免疫抗体库：
与天然抗体库不同，免疫抗体库由经过免疫(包括疫苗注射、微生物感染、自身免疫疾病、肿瘤等)后的供体B 淋巴细胞的抗体基因构建，含有大量针对该特定抗原的抗体，筛选背景大大降低，而且这些抗体基因经过宿主体内亲和力成熟过程，亲和力往往不会太低。但一般仅适用于一种特异性抗体的选择，库容量要求不高，一般10^6-10^8的库容量就可满足需要。但是人体不能随便免疫，制备全人源抗体时会受到限制。
半合成抗体库：
基于天然抗体库的框架区以及CDR1和CDR2区，通过随机合成扩增CDR3区的DNA序列，能够获得半合成抗体库。我们已经介绍过，CDR3是决定抗体特异性的最重要部位，在B细胞个体发生过程中，结构及序列的多样性变化最大，所以最常见是在CDR3引入随机突变，同时考虑长度的变化。另外还有通过抗体基因信息设计合成的纯人工合成库。
好了，咱们今天就说到这吧，感兴趣的同学欢迎后台留言以及点赞、关注我们~咱们下期见！我是老熊，一个立志用通俗易懂的语言带你玩转科研的忍者~
参考文献
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[3] Kumar R, Parray HA, Shrivastava T, Sinha S, Luthra K. Phage display antibody libraries: A robust approach for generation of recombinant human monoclonal antibodies. Int J Biol Macromol. 2019;135:907-918.
[4] Barbas Iii C F , Burton D R , Scott J K ,et al.Phage display : a laboratory manual[J].Quarterly Review of Biology, 2001(4).
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