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导读
自从 100 多年前发现噬菌体以来，它们在基础和应用生命科学中得到了广泛的利用。噬菌体展示技术是将肽序列呈现在噬菌体病毒颗粒表面的技术，已有 30 多年的发展历史。噬菌体展示系统的改进使这种方法应用于生物技术的许多领域，如免疫学和生物医学的应用、新材料的形成等。2018 年诺贝尔奖“噬菌体展示多肽和抗体”表彰噬菌体展示平台的重要性。因此，基于噬菌体展示等多肽展示系统的新型复杂工具不断涌现，有望在不久的将来为解决各种科学、医疗和技术问题提供新的机会。
#1
噬菌体展示原理
噬菌体展示技术是通过对噬菌体 DNA 进行遗传修饰，使噬菌体表面的肽/蛋白/抗体片段与噬菌体衣壳蛋白结合而表达的一种分子技术。外源 DNA 序列被引入噬菌体基因组核苷酸序列的特定位置，编码噬菌体的一种衣壳蛋白（图1）。当噬菌体感染发生时，噬菌体基因开始在细菌宿主体内表达，插入的肽/抗体片段随后作为编码衣壳蛋白的相关基因和克隆序列的组合产物在噬菌体表面展示。因此，如果克隆序列是随机的，可以同时构建噬菌体展示文库，提供 >1010 突变体，并作为 DNA 克隆长期储存，而不需要单独构建各种多肽或抗体片段。噬菌体展示技术的强大之处还在于它能够在显示分子（表型）和编码显示分子（基因型）的 DNA 序列之间形成直接联系。这种表型-基因型的联系支持特定克隆的选择，并允许通过对噬菌体基因组中的某些插入片段进行 DNA 测序，立即测定特定结合物（肽或蛋白质）的氨基酸序列。
噬菌体展示实验有几个关键步骤，首先是文库设计，可以包括数百万个或更多携带靶序列的 DNA 克隆，构成展示肽/蛋白质的 DNA 序列主要被克隆到噬菌粒载体上。用所得噬菌粒文库转化大肠杆菌细胞，并在辅助噬菌体感染后，产生噬菌体展示文库。该文库针对先前固定的目标进行亲和筛选。需要仔细的洗涤步骤来去除未结合的噬菌体。洗涤后，与靶标相互作用的噬菌体在大肠杆菌中被洗脱和扩增。整个循环重复几次（通常3-5次）以选择最特异性结合的肽/蛋白质。经过数轮的生物淘选后，对获得的序列进行功能分析。这种选择过程称为生物淘选，可以相当容易地识别特定的噬菌体颗粒。
#2
丝状噬菌体
噬菌体展示技术的发展是在对噬菌体，尤其是丝状噬菌体的生物学特性有了详细的了解之后才有可能实现的。Ff 噬菌体（丝状噬菌体家族的一部分）是一类能够感染携带F质粒的革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌）的病毒。在噬菌体展示方面，Ff 群是整个丝状噬菌体家族中最重要的一群，包括噬菌体 M13、fd 和 f1。噬菌体展示技术中最常用的丝状噬菌体是噬菌体 M13，主要是由于其能够将外源 DNA 的长片段整合到其基因组中。
Ff 组具有单链（ss）DNA基因组，在不同菌株之间具有 98% 的相似性，因此，它非常适合用于基因工程。M13 具有 6.4 kb 环状 ssDNA 基因组，其直径为 6.5 nm，长度为 930 nm。有趣的是，插入长达 12 kb 的 外源DNA（几乎是野生型噬菌体基因组长度的两倍）并不影响 Ff 噬菌体的功能。Ff 噬菌体的基因组由 11 个基因组成，根据相应基因编码的蛋白质的功能分为以下几类：衣壳蛋白包括 pIII, pVI, pVII, pVIII 和 pIX， DNA 复制蛋白称为 pII, pV 和 pX，以及组装蛋白包括 pI, pIV 和pXI 。两个次要衣壳蛋白 pIII 和 pVI 位于噬菌体病毒粒子的一端，另一端有两个附加的次要衣壳蛋白pVII 和 pIX。噬菌体衣壳由主要衣壳蛋白 pVIII 组成，pVIII 由基因组周围的数千个拷贝聚合而成 。
George Smith 于 1985 年首次证明，可以展示与丝状噬菌体 f1 衣壳融合的外源蛋白质，同时保持病毒感染性和蛋白质的生物活性。尽管随后还构建了许多其他的展示系统（基于不同的噬菌体、各种细菌、酵母和哺乳动物细胞以及无细胞的细胞），但以 Ff 噬菌体为基础的展示系统仍然是数量最多、使用最多的。这是由于噬菌体结构简单、易于用噬菌体 DNA 进行遗传操作以及噬菌体在细菌细胞内高效增殖，使在短时间内获得大量病毒粒子成为可能。
噬菌体展示的关键衣壳蛋白是 pIII（406 个氨基酸残基）。pIII 蛋白以 3-5 拷贝的形式出现在噬菌体的顶端，它由三个不同的结构域组成。N1 结构域是病毒 DNA 在感染过程中转移到大肠杆菌的开始，而 N2 结构域通过将噬菌体蛋白 pIII 附着在大肠杆菌的 F 菌毛上来提供宿主细胞识别。蛋白质或肽展示在 pIII 的 N 端，但展示的分子通过连接肽与 pIII 的 N 端残基分离。C 末端结构域负责将 pIII 整合到噬菌体衣壳中，并且是衣壳结构的组成部分。
pIII 蛋白的展示会在噬菌体尖端产生每个特定肽的 3-5 个拷贝的文库。相对较大的分子，多达 38 个氨基酸，可以被整合到 pIII 蛋白的 N 端而不失去任何噬菌体感染性。事实上，在所有丝状噬菌体衣壳蛋白中，只有 pIII 蛋白大到足以向 B 细胞和 T 细胞呈递多个表位。
#3
用于筛选抗体的
噬菌体展示文库的
主要类型
通用抗体噬菌体展示文库，通常包含超过百亿个独特的序列，已成为发现针对任何类型目标的单克隆抗体（mAbs）的宝贵来源。根据多样性来源，抗体噬菌体文库可分为自然、全合成和半合成文库（图5）。在自然文库中，多样性完全来自自然库，可以是健康、自免疫或免疫供体。理论上，可使用大型的“天然”文库来分离针对任何目标的抗体，但如果文库来自免疫供体，多样性将高度偏向特定目标。对于来自人源库的免疫文库，可以来自疫苗接种供体或已从感染或疾病中康复的供体。在全合成文库中，通常选择最具代表性的人源抗体基因库作为抗体框架。互补决定区（CDRs）根据抗体结构和应用目的进行设计。用于创建 CDR 多样性的合成 DNA 的质量在决定合成文库的功能性大小方面起着关键作用。通过使用单核苷酸或三核苷酸磷酰胺（TRIM技术）作为构建模块，可以高效合成多样化的 CDRs，例如基于阵列的寡核苷酸合成和 Slonomics 技术等。在 TRIM 技术中，每个氨基酸由一个定义的密码子编码。因此，可精确定义所需位置的氨基酸分布。此外，由于为每个氨基酸优化了用于抗体表达的密码子，功能性文库的库容增加了。半合成文库将合成 CDR（通常为三个轻链 CDR 和重链 CDR1 和 CDR2）与自然库中的重链 CDR3 结合起来。
#4
噬菌体展示来源的
单克隆抗体
在 1990 年 McCafferty 和 Winter 的开创性报告发表 20 年后，有 70 多种噬菌体来源的单克隆抗体进入临床研究，截至 2022 年 11 月，其中 17 种已被批准（表1）。例如，阿达木单抗（Adalimumab）是第一个噬菌体展示的人 IgG1-κ源性单克隆抗体，采用小鼠单克隆抗体人源化“guided selection method”开发。2002 年，阿达木单抗是第一个由噬菌体展示技术获得美国 FDA 批准用于治疗的人抗体。阿达木单抗与肿瘤坏死因子（TNF）结合并抑制 TNF 受体（TNF-R1和-R2）结合和激活，因此表现出非常高的特异性和亚纳摩尔亲和力。除此之外，还有许多其它抗体正处于临床试验阶段。并且由于技术的不断发展，以及相关关键专利保护到期，预计未来将有越来越多的噬菌体来源的单克隆抗体进入临床试验和市场。
#5
结语
噬菌体展示技术已成为最常用的筛选人类单克隆抗体方法之一，尤其是基于丝状噬菌体的方法。近年来，噬菌体展示相关的研究取得了明显进展，已有 17 种噬菌体来源的单克隆抗体获得批准。许多研究机构、初创企业和工业实验室正在不断改进抗体噬菌体库的设计、构建和筛选方法。预计未来将进一步改进此技术，为研究、诊断和治疗做出更大贡献。
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参考图片 & 图片来源：
1. Jaroszewicz W, Morcinek-Orłowska J, Pierzynowska K, et al. Phage display and other peptide display technologies[J]. FEMS Microbiology Reviews, 2022, 46(2): fuab052.
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合肥科生景肽生物科技有限公司成立于2018年，目前已经打造了全球领先的以肽为核心的生命分子发现、合成生产、结构优化、递送平台，主要瞄准肽发现及靶向递送，专注于为各大制药企业、生物技术公司、科研单位提供一站式的定制化研发服务。 公司独有的KPDS™平台(KS-V Peptide Discovery Services Platform)是国际领先的的多肽药物发现平台，我们致力于创新药物的高效和精准开发，以科生景肽专有KPDS技术为核心，提供一站式，定制化的多肽发现服务，以灵活的产品形式和服务模式助力广大客户各类药物发现项目的快速推进和应用探究，包括但并不限于疾病诊断及保健功能产品、多肽药物、核素偶联药物(RDC)、基于小分子的肽药物偶联物（PDC)和多功能肽偶联物等。中文官网地址：https://www.ks-vpeptide.com.cn/
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