前言
2018年10月诺贝尔化学奖的一半颁发给了美国科学家George P. Smith和英国科学家Gregory P. Winter, 两人获奖的原因是多肽和抗体的噬菌体展示技术。其中George P. Smith是噬菌体展示技术的搭建者，其创造性的开创了这个技术的平台化方法，而Gregory P. Winter利用此技术开发了第一个全人的抗体药物，用于治疗类风湿性关节炎，银屑病等，也就是大名鼎鼎的药王阿达木单抗，2017 年其全球销售额达到 185 亿美元，累计销售额1159亿美元。噬菌体展示技术在生物医药研发中有着十分广泛的应用，是生物新药研发的源头技术，笔者从该技术的医药工业从业者角度拟用5篇左右的篇幅描述该技术发明至今，噬菌体展示技术的作用原理，应用价值和实践操作指南，也就是讲讲此技术有什么用，为什么能这么用，以及该怎么去用的问题，希望志同道合者能够在实践中一起交流讨论，成长进步。
噬菌体展示技术简介
噬菌体展示技术称之为能够驾驭演化的力量，关于生物进化，演化理论，最为著名的莫过于达尔文的进化论。 “物竞天择，适者生存”，达尔文认为，生物之间存在着生存争斗，适应者生存下来，不适者则被淘汰，这就是自然的选择。生物正是通过遗传、变异和自然选择，从低级到高级，从简单到复杂，种类由少到多地进化着、发展着。生物的遗传、变异造就了种群的多样性，自然环境的某些关键恶劣条件作为筛选压力使得种群的多样性部分丧失的同时，种群能够在对筛选压力的适应下生存延续。生物和环境之间的相互作用是复杂系统中多个性状多样性和多个条件筛选压力之间的复杂的交互作用，与此相比，噬菌体展示技术是复制生物的某单一性状多样性和选择单一筛选压力进行相互作用，有目的的获得能够适应该筛选压力的性状的技术。具体到噬菌体抗体展示技术，通常是通过大肠杆菌丝状噬菌体M13的基因工程改造复制生物的抗体的遗传基因的多样性，并将基因编码的抗体和噬菌体的膜蛋白融合展示在噬菌体表面，选择是否能够和某个特定的靶点蛋白结合作为筛选压力，有目的的得到能够和该特定靶点蛋白结合的抗体及其遗传信息的技术。噬菌体抗体展示技术突破性贡献在于建立体外抗体功能和其对应的遗传信息的直接联系，筛选到有功能的抗体的噬菌体的同时也就得到了该噬菌体内蕴含编码抗体对应的遗传信息。
抗体的蛋白和遗传信息的多样性
抗体蛋白以一个Y 字形单体或者多个Y 字形单体存在单抗,每个 Y 字形单体由 4 条多肽链组成,包含两条相同的重链和两条相同的轻链。Y 字形结构的顶端是可变区,为抗原结合部位，其余部分为较为保守的恒定区。单个抗体可变区称之为scFv( single-chain variable fragment)由重链可变区和轻链可变区通过共价键和非共价键结合折叠成球状结构，轻重链可变区由4个变化频率相对恒定的框架区（FWR）和夹杂其中3个高变区（CDR）组成，高变区也称为互补决定区，轻重链的6个互补决定区在三维结构上空间距离很近，形成蛋白环状结构，是与抗原结合的关键区域。
轻重链可变区分别由轻链V基因和重链V基因编码，其中轻链V基因有两种类型，kappa轻链和lamda轻链，由VL片段和JL片段或者VΚ片段和JΚ片段组装而成，重链V基因由VH片段，DH和JH片段组装而成。如下图据不完全统计人体内30条以上的轻链重链V片段，23条重链D片段, 4-6条轻重链J片段，其排列组合组成了抗体遗传信息的多样性。一般来说抗体蛋白重链的CDR3区域是抗原结合的关键区域，其主体是由DH片段决定，但在重链V基因V,D,J组装过程中，VH片段和JH片段也会插入数量不等的核苷酸进入CDR3区域，进一步增加了CDR3的多样性，理论上人体的抗体遗传信息的多样性可高达5E13次方，人类在漫长的时间里积累的十万亿级别多样性的抗体文库可以说能够和地球上任何一种已知或者未知的大分子小分子实体产生反应，足见生命演化力量之伟大，而噬菌体展示技术将会驾驭这股演化多样性的力量！
采用噬菌体展示技术的上市抗体
如下表，据不完全统计在抗体研发阶段采用噬菌体展示技术的上市抗体10个，受限于噬菌体展示技术的专利限制，该技术的利用在一段时间内只掌握在少数公司手中，这也是从第一个利用噬菌体展示技术的抗体阿达木于2002年上市的后面十年少有利用该技术的抗体上市的根本原因。随着Breitling/Dubel (EP0440147) 和 McCafferty/ Winter (EP0774511, EP0589877)专利家族在欧洲于2011年到期，美国的专利US5969108 (filed 1990, granted 1991, published 1999), US6172197 (filed 1991, granted 1995, published 2001) and US6806079 (filed 1990, granted 2000, published 2004) 到期日期相对复杂，受到申请日期和授予日期影响，但最迟也会在最近几年到期，出于噬菌体展示技术在抗体发现和优化中的相当明显的效率优势，利用噬菌体展示技术的上市抗体将会越来越多1。
噬菌体展示技术优势和应用
噬菌体展示技术不论是作为抗体发现的源头技术，还是作为抗体工程中抗体特性改造中的筛选工具都有着现有传统技术无可替代的优势和多方向领域的应用。
1.相对于传统的鼠免疫杂交瘤技术，采用人的天然噬菌体文库筛选出来的抗体是全人的，能够有效的降低免疫原性的风险，这个在需要长期定期注射给药的慢性病如类风湿疾病治疗中是十分关键的一个因素。
2.相对于转基因小鼠进行全人抗体的发现，需要体内免疫小鼠，一些人鼠同源性较高保守的蛋白，毒性较大的蛋白如针对炭疽毒素的上市抗体Raxibacumab，抗原不稳定的蛋白，有变构的蛋白以及多透膜的蛋白并不适用于体内筛选，人的噬菌体文库为体外筛选的模式能够进行更多靶点分子的抗体发现。而且噬菌体展示技术未经过体内免疫的过程，能够对单个靶点多表位（尤其是人鼠同源性较高的保守表位）的抗体发现。
3.相对基于免疫的体内抗体发现技术，动物免疫，后期的杂交瘤融合，单克隆筛选等繁琐细胞培养过程，噬菌体展示其淘选，筛选过程在大肠杆菌中进行，扩增过程非常简单，抗体发现的时间周期短，实验出现意外的风险低，试剂耗材和人力成本更低。
4.免疫后的动物能够抽取其B细胞进行免疫噬菌体文库的建立，综合体内免疫和噬菌体体外筛选的两方面优势。如第一个上市纳米抗体Caplacizumab是免疫羊驼然后利用噬菌体文库技术筛选出来的，此方法在科研用的工具抗体筛选和发现中有极大的作用。
5.对现有的抗体的基因序列进行随机或者定点突变构建突变文库，进行人源化或者亲和力成熟，筛选出亲和力更强的抗体或者条件激活抗体等，如Genetech的Ranibizumab和Bevacizuma上市抗体都是源于鼠克隆单抗体A4.6.1，Bevacizuma抗体的人源化是将CDR区移植到人的框架区(VLκ1, VHIII)然后经过定点突变得到的，而Ranibizumab的人源化是将CDR区域移植在不同的人的轻重链框架区构建噬菌体文库筛选得到的高亲和力抗体2。
6.以现有的抗体为导标（Guided selection），利用天然噬菌体文库筛选出与该抗体作用于靶点一样表位的多个新序列抗体，能够取得和导标抗体体内药效一致的新序列抗体，如阿达木是以鼠单抗MAK195为导标，利用噬菌体展示，通过Guided selection筛选得到的3。
7.挑选抗体轻重链框架区相对固定的组合构建CDR区多样的合成的噬菌体文库，轻重链框架区相对固定的组合移除了潜在的翻译后修饰位点（PTMs），使得筛选出来的抗体均有较好的理化特性，降低后期CMC的难度。如MorphoSys的Ylanthia合成噬菌体文库4。
8.嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法的CAR通常是scFv，这个和噬菌体展示的scFv文库有相似的展示环境，利用噬菌体展示技术寻找CART中的CAR（嵌合抗原受体）是创新CAR-T疗法的关键5。
9.噬菌体展示多肽的技术在药物研发领域也有十分广泛的应用4。
展望
近期FDA批准了阿达木的第三个单抗类似物Hyrimoz，阿达木类似物在欧洲开卖，引起了abbvie的剧烈反弹，宣布在欧洲降价80%，以20%的价格和单抗类似物进行竞争，当失去了价格优势，没有了规模效应的生物类似物的出路何去何从？国内已申请或者开展临床的该单抗的类似物仿制的企业就有数十家，如果没有了盈利的现实基础，企业对此类似物的前期研发投入将是对医药研发资源的极大浪费，如果考察阿达木的初期发现历程3，将这些资源的一部分倾斜到噬菌体展示平台的搭建上，采用噬菌体展示技术Guided selection的方式，以阿达木或者鼠单抗MAK195为导标，进行全新抗体序列的筛选，能够得到和阿达木作用靶点的相同表位的多个新序列实体抗体，而且能够避开阿达木的专利保护时间拥有自身的专利，以me-too或者me-better的方式更快速的方式进行项目的研发，结局会大不一样吧。
噬菌体展示技术是生物创新医药研发的源头技术，其在新的抗体和多肽的发现和优化过程中有着核心的作用，并能够和传统的抗体发现平台进行有效对接，能够广泛用于抗体，抗体偶联药物和CAR-T/TCR-T等领域。随着噬菌体展示技术的专利在全球范围陆陆续续的过期，每个有志于生物制品创新医药研发的企业建立一个噬菌体展示平台并努力扩展其应用范围正当时！作为从业者，国内此块的研发人员也不会太多，没有足够成熟的平台，希望彼此之间能够相互交流讨论磨砺技能，有意者可联系biocommunity@126.com一起交流讨论成长进步。
文献资料：
1.André Frenzel, Schirrmann T , Hust M . Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy[J]. mAbs, 2016, 8(7):18.
2.Nixon A E , Sexton D J , Ladner R C . Drugs derived from phage display: From candidate identification to clinical practice.[J]. Mabs, 2014, 6(1):73.
3.Osbourn J , Groves M , Vaughan T . From rodent reagents to human therapeutics using antibody guided selection[J]. Methods (Amsterdam), 2005, 36(1):0-68.
4.Tiller T , Schuster I , Dorothée Deppe, et al. A fully synthetic human Fab antibody library based on fixed VH/VL framework pairings with favorable biophysical properties[J]. mAbs, 2013, 5(3):26.
5.Shirasu N , Shibaguci H , Kuroki M , et al. Construction and molecular characterization of human chimeric T-cell antigen receptors specific for carcinoembryonic antigen[J]. Anticancer Research, 2010, 30(7):2731.
合肥科生景肽生物科技有限公司成立于2018年，目前已经打造了全球领先的以肽为核心的生命分子发现、合成生产、结构优化、递送平台，主要瞄准肽发现及靶向递送，专注于为各大制药企业、生物技术公司、科研单位提供一站式的定制化研发服务。 公司独有的KPDS™平台(KS-V Peptide Discovery Services Platform)是国际领先的的多肽药物发现平台，我们致力于创新药物的高效和精准开发，以科生景肽专有KPDS技术为核心，提供一站式，定制化的多肽发现服务，以灵活的产品形式和服务模式助力广大客户各类药物发现项目的快速推进和应用探究，包括但并不限于疾病诊断及保健功能产品、多肽药物、核素偶联药物(RDC)、基于小分子的肽药物偶联物（PDC)和多功能肽偶联物等。 中文官网地址：https://www.ks-vpeptide.com.cn/ 英文官网地址：https://www.ks-vpeptide.com
