食管癌前病变到食管癌演进的异常上皮细胞互作机制

中国医学科学院肿瘤医院团队揭示推动食管癌前病变到食管癌演进的异常上皮细胞互作机制

2023年12月15日，中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院林东昕、吴晨课题组在Signal Transduction and Targeted Therapy

上发表了文章Aberrant epithelial cell interaction promotes esophageal squamous-cell carcinoma development and progression的研究性论文。通过对小鼠和人类多阶段食管鳞状细胞癌（ESCC）样本进行了空间转录组和功能分析揭示了TP53-TP63/ΔNP63-EFNB1-EPHB4轴在上皮癌形成中的EMT和细胞增殖中的作用。

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研究背景与研究目的

食管鳞状细胞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma，ESCC）是全球范围内最常见的胃肠恶性肿瘤之一。该疾病的发展过程往往是由慢性炎症（INF）开始，逐渐演变为低级别上皮内瘤变（LGIN）和高级别上皮内瘤变（HGIN），最终发展成为侵袭性食管癌[1]。据前瞻性研究显示，74%的HGIN病例和31%的LGIN病例最终发展为食管癌[2]。因此，寻找食管上皮从正常状态发展到恶性状态过程中的分子机制，对于食管癌的早期检测、诊断和治疗至关重要。

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 研 究 结 果

通过对接受4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQO）的自发食管鳞癌小鼠模型的不同癌变阶段的组织进行了空间转录组测序，并结合本课题组之前发表的人和小鼠食管癌多阶段组织的单细胞转录组测序[3-6]

鉴定了在空间和时间上都逐步扩增侵袭的癌变上皮区域EDR，并发现这一区域上皮细胞粘附和细胞生长有所增强。

之后我们希望探究上皮恶变的原因，结合之前的富集分析，我们将目标放在上皮互作上，基于小鼠自发食管癌的空间转录组和单细胞转录组，我们解析了ESCC发生过程中上皮细胞异常互作的多阶段多区域的动态演变，鉴定了在空间和时间上均存在显著随癌变扩张的关键互作对EFNB1-EPHB4，这一结果我们在蛋白层面上也得到了验证。

接下来，为了证明食管癌变过程的上皮异常互作在人的组织也存在，我们对之前实验室发表的人的单细胞和空间转录组数据也进行了分析。我们发现人组织中也存在随癌变在时空上扩张的EDR区域，并且其中EFNB1-EPHB4异常互作也十分显著。这一结果也在人组织蛋白中得到了验证。

接下来，我们希望探究EFNB1-EPHB4异常互作是否是食管鳞癌的癌变推动者？首先，我们用IP等实验证明了EFNB1-EPHB4异常互作确实发生在小鼠和人的食管上皮细胞间。接下来我们发现EFNB1和EPHB4关联基因富集在细胞增殖迁移等通路。于是我们检测了细胞增殖和迁移能力，与我们的预想一致，我们发现EFNB1-EPHB4互作确实能显著的增强正常上皮和癌上皮细胞的增殖和迁移能力。在小鼠皮下成瘤实验中，也显著提高了肿瘤大小。另外我们也发现，在多个食管癌队列中，EFNB1和EPHB4均与患者生存显著负相关。

那么EFNB1-EPHB4推动癌发生的机制是什么呢？结合我们之前的富集分析，我们锁定在了EMT方向，与以往的常规观点不同，我们认为食管上皮细胞在癌前病变阶段可能就已经发生了EMT并因此获得生存和增殖的优势。于是我们检测了EFNB1-EPHB4异常互作增强后的EMT和细胞周期因子。不出所料，EFNB1-EPHB4这一上皮异常互作确实诱发了上皮EMT和细胞周期加速。接着我们又发现这一过程是由受体EPHB4下游的SRC/ERK/AKT的磷酸化信号传递所实现的。

最后，我们想知道上皮异常互作的罪魁祸首是什么？于是通过转录因子预测分析和实验验证，我们锁定了ΔTP63这一食管鳞癌中的重要促癌转录因子。我们通过ChIP和双荧光素报告酶实验等方法，证明了ΔTP63可以同时促进EFNB1和EPHB4的转录，推动癌变。

那么TP63又是为何发生改变的呢？我们追本溯源，进一步发现这一异常互作的真正罪魁祸首是上皮细胞的TP53失调，导致了TP63的拷贝数扩增，并进而导致食管ΔTP63蛋白增加，介导了EFNB1和EPHB4的转录上调。这句话改为：那么TP63又是为何发生改变的呢？我们通过多组学分析和体内外实验，进一步发现这一异常互作的真正罪魁祸首是上皮细胞的TP53失调，导致了TP63的拷贝数扩增，并进而导致食管ΔTP63蛋白增加，介导了EFNB1和EPHB4的转录上调。

研 究 结 论

该研究运用致癌物4NQO诱发的小鼠食管癌变模型，对不同癌变阶段的组织进行了空间转录组测序，并结合他们之前发表的小鼠和人食管癌的单细胞转录组测序[3,4]，在上皮组织的空间上鉴定出逐步恶变的区域，解析了邻近上皮细胞间互作失控会引起上皮细胞增殖并使上皮细胞向间质细胞转化，从而破坏了上皮组织正常结构，导致食管癌形成。其中上皮细胞膜受体EFNB1和其配体EPHB4表达异常是引起上皮细胞互作异常的原因。

该团队长期致力于食管癌遗传学和基因组学的研究，近期的工作揭示了食管鳞状上皮细胞P53基因双等位丢失或多位点突变是食管癌前病变向食管癌演进的关键因素。在早期的癌前病变中，就含有一些P53突变的克隆。P53突变引起基因组一些区域DNA缺失或扩增，结果发表于2023年的Cancer Cell期刊[7]。为了进一步阐明P53失活导致食管癌变演进的机制，他们接着研究了拷贝数丢失或扩增区域的基因功能。揭示位于拷贝数丢失区域的KLF4缺失，使受其调控的基因ANXA1无法正常表达，从而导致上皮细胞与其基质中的成纤维细胞的稳态受到破坏，成纤维细胞因此转化为癌相关成纤维细胞，促进癌前病变细胞不断向恶性细胞演进，该结果也发表于2023年的Cancer Cell期刊[5]。

吉 凯 助 力

本文中EFNB1和EPHB4的稳定过表达和稳定敲降病毒均由上海吉凯基因提供。

作 者 介 绍

中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院林东昕院士和吴晨教授为本研究共同通讯作者。博士生陈丽萍、祝世昊为共同第一作者。

1     Nagtegaal, I. D. et al. The 2019 WHO classification of tumours of the digestive system. Histopathology 76, 182-188, doi:10.1111/his.13975 (2020).

2     Wang, G. Q. et al. Histological precursors of oesophageal squamous cell carcinoma: results from a 13 year prospective follow up study in a high risk population. Gut 54, 187-192, doi:10.1136/gut.2004.046631 (2005).

3     Yao, J. et al. Single-cell transcriptomic analysis in a mouse model deciphers cell transition states in the multistep development of esophageal cancer. Nat Commun 11, 3715, doi:10.1038/s41467-020-17492-y (2020).

4     Zhang, X. et al. Dissecting esophageal squamous-cell carcinoma ecosystem by single-cell transcriptomic analysis. Nat Commun 12, 5291, doi:10.1038/s41467-021-25539-x (2021).

5     Chen, Y. et al. Epithelial cells activate fibroblasts to promote esophageal cancer development. Cancer Cell 41, 903-918.e908, doi:10.1016/j.ccell.2023.03.001 (2023).

6     Liu, T. et al. Computational Identification of Preneoplastic Cells Displaying High Stemness and Risk of Cancer Progression. Cancer Res 82, 2520-2537, doi:10.1158/0008-5472.Can-22-0668 (2022).

7     Chang, J. et al. Genomic alterations driving precancerous to cancerous lesions in esophageal cancer development. Cancer Cell 41, 2038-2050.e2035, doi:10.1016/j.ccell.2023.11.003 (2023).