摘要：多肽药物因具有相对成本低,生物活性强,副作用小,不蓄积中毒,作用靶点专一等特点而被人们广泛应用。但天然存在的多肽类药物含量较少、纯度较低,无法满足临床的需求。经研究发现,通过体外合成的多肽药物具有合成周期短、生产量大等优势,能够有效克服天然多肽药物的不足,对于推广多肽类药物的应用有重要意义。本文对多肽类药物体外合成方法进行综述,为其今后的发展和临床应用提供参考。

关键词： 多肽药物 体外合成 化学合成 基因重组

多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质,它的分子结构介于氨基酸和蛋白质之间[1]。目前,人们已发现和分离出100 多种存在于生物体内的多肽类化合物[2]。而多肽类药物已广泛涉足抗肿瘤药物、心脑血管药物、抗病毒多肽、抗菌性活性肽以及疫苗、诊断试剂盒等领域[3 – 8]。但是,天然的多肽类药物因含量少、纯度低等缺陷,无法满足临床应用的需求。近年来,人们对于多肽药物的研究不断深入,多肽的合成方法也日渐成熟,使得资源匮乏、疗效显著的多肽药物达到了产业化的目的。本文对多肽药物的化学合成方法和基因重组技术等进行了综述,以期能对多肽类药物的体外合成提供参考。

1 多肽药物的化学合成

1. 1 化学合成的基本原理

在温和反应条件下,肽键的形成是通过活化一个氨基酸( A) 的羧基部分,第二个氨基酸( B) 则亲核进攻活化羧基部分而形成二肽[9]。多肽的合成包括3 个步骤: 第1 步,对缩合反应中不参与反应的活性部分进行保护; 第2 步,N – 保护氨基酸的羧基必须先活化为活性中间体,随后与羧基保护的氨基酸进行缩合形成肽键; 第3 步,对所保护的基团进行选择性的脱保护,最终得到所要合成的多肽[10]。

1.1.1官能团的保护和脱保护

α – 氨基的保护及脱保护: 氨基是一个活性大、易被氧化的基团,在有机合成中需要用易于脱去的基团进行保护。氨基酸中用于氨基保护的保护基数目很多,按其结构可分为烷氧羰基、酰基、烷基3 大类。烷氧羰基是目前应用最广的氨基保护基( 烷氧羰基可防止消旋化) 。表1 列举了几种有代表性的烷氧羰基保护基及脱保护条件。

表1 氨基保护基及脱保护条件

α – 羧基保护及脱保护: 羧基在氨基酸中具有重要的生物活性,就其结构和性质而言,羧基虽然没有氨基、醛基那么活泼,但在合成中也经常需要保护,以便分子其他部位进行特定反应。多肽中 α -羧基的保护基团相对较少,主要是对羧基起临时保护作用的盐类和由一级、二级或三级醇制备的酯。表2 列举了几种常见的羧基保护基。

表2 羧基保护基及脱保护条件

侧链官能团保护及脱保护: 不少氨基酸的侧链上都带有易参与反应的活性基团,如羟基、巯基、酚基、胍基、咪唑基、吲哚基等。为了避免副反应的发生,在多肽合成中往往也选用适当的保护基将其保护起来。表3 列出了几个侧链官能团的常用保护基及脱保护条件。

1.1.2肽键的生成方法

( 1 ) 叠氮法: 叠氮法是古老的肽键缩合方法之一,在肽缩合反应过程中,叠氮物法能够让氨基酸很少发生消旋作用,因此,该方法一直被肽合成工作者广泛使用。叠氮法接肽分为3步: 首先,羧基部分被甲酯、乙酯、苄酯等保护的肽在室温下进行肼解生成酰肼,然后酰肼在低温( – 15℃ 以下) 和酸性条件下与亚硝酸化物反应生成叠氮物,最后用有机碱调节p H至8 ~ 9,加入氨基组分完成接肽反应[11]。( 2) 混合酸酐法: 混合酸酐法是指先将保护的氨基酸的羧基制成高活性的混合酸酐,之后与氨基缩合生成肽的方法[12]。该方法是20 世纪50 年代初期开始发展起来的,开始使用的制备混合酸酐的试剂主要是二苯基磷酸,然后是苯甲酸,现在应用最广的是氯甲酸烷基酯类,主要有氯甲酸乙酯、氯甲酸异丁酯和氯甲酸异丙酯[13]。混合酸酐法具有反应速度快、产物纯度高、产率高、经济性好等优点,因此备受当今药学工作者的厚爱。( 3) 其他方法: 以上两种方法是化学法合成肽键最常用的方法。此外活化酯法,酰卤法和缩合剂等法也用于肽键的缩合,应根据不同的多肽中的氨基、羧基和侧链基团的结构的不同选择适当的缩合方法参与肽键的形成。

表3 侧链保护基及脱保护条件

1. 2 多肽药物化学合成的分类

多肽的化学合成根据是否使用固相载体分为液相合成和固相合成两种方法。

1.2.1多肽药物的液相合成

多肽的液相合成主要在液体中进行,故称之为液相合成法,有逐步合成和片段组合两种策略[14]。逐步合成简洁迅速,用于各种生物活性多肽片段的合成; 片段组合法为合成多肽提供了最有前途的路线,并已成功地合成了多种具有生物活性的多肽,其最大特点是易于纯制[15]。

对于由较少氨基酸组成的多肽,采用液相合成法方便快速,纯度高,且能够大量合成。孙永强等[16]以Fmoc为侧链氨基酸保护基团,逐步缩合合成了十肽曲普瑞林,并且合成的曲普瑞林具有较高的收率。功能化离子液体为载体液相合成技术在多肽的合成反应中体现出了明显的优势: 反应的选择性、速度和收率得到了显著的提高,反应后处理方便,离子液体可回收使用等。徐中义等[17]以功能化离子液体为载体成功地合成了RGD三肽,并且目标化合物不需要进一步的色谱纯化,产率为84% 。此外研究还发现,一些氨基酸经过抗酸性和易于裂解的疏水基团修饰后,通过液相合成的多肽类药物更容易纯化和制备。Okada等[18]以苄醇类疏水基团作为辅助支持物引入多肽的液相合成当中,并且成功地合成了克级的亮丙瑞林,比伐芦定,胃促生长素等多肽类药物[19]。同样利用疏水标记辅助液相合成技术成功地合成了生长激素抑制肽———生长抑素。

1.2.2多肽药物的固相合成

固相合成法是将氨基酸的C末端固定在不溶性树脂上,然后在此树脂上依次缩合氨基酸,延长肽链的多肽合成方法[20]。自1963 年Merrifield[21]发展成功了固相合成法合成多肽以来,经过不断的改进和完善,到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术,表现出了经典液相合成法无法比拟的优点。其中 α – 氨基用Boc( 叔丁氧羰基) 保护的称为Boc固相合成法,α -氨基用Fmoc( 9 – 芴甲氧羰基) 保护的称为Fmoc固相合成法[22]。

现如今固相合成法已经广泛应用到多肽合成的各个领域中,对于< 30 个氨基酸的多肽一般首选固相合成法。石卫华等[23]应用Fmoc固相合成法,以Rink Amide – AM Resin为载体,DIC / HOBt或DIC /HOAt为缩合剂,采用制备型反相高效液相色谱法进行纯化,结果合成了纯度高达99% ,总收率为62% 的西曲瑞克精肽。Dixon等[24]通过固相合成法合成了一种结构为环五肽的几丁质酶抑制剂———argifin,该合成方法的特点是在argifin成环之前,一个受保护的门冬氨酸( Asp) 首先与固相支持物相连接,然后通过Fmoc固相合成法形成一条线性肽链,参与该多肽的合成。Afonso等[25]将硼酸基团引入到侧链保护基团中,并联合应用微波辅助Suzuki -Miyaura相互作用形成环肽,成功地合成了一种联芳环肽类药物,该联芳环肽类药物的特点是第3 位的氨基酸被取代为3 – 芳基酪氨酸,以便能够简明和高效的固相合成。

2 多肽药物的基因重组技术

基因的表达包括相应的mRNA合成( 转录) 和蛋白质合成( 翻译) ,在微生物体内进行外来基因的蛋白质生物合成依赖于微生物遗传物质和编码目标蛋白的重组DNA片段[26]。具体步骤如下: 第1 步,从供体中分离出编码蛋白的DNA片段; 第2 步,将DNA分子插入到表达载体上; 第3 步,将载体转染到宿主体内; 第4 步,培养宿主组织,进行基因的扩增,mRNA合成和多肽的合成; 第5 步,纯化重组多肽[27]。通常根据宿主细胞的不同将多肽药物重组技术分为两类: ( 1) 多肽药物的真核表达; ( 2) 多肽药物的原核表达。

2. 1 多肽药物的真核表达

真核表达的多肽具有定向性强、产品安全卫生、原料来源广泛和成本低等优点,可以得到质量高、疗效好的且活性与天然多肽相当多肽类药物。目前,真核宿主细胞主要有酵母菌、动物和昆虫细胞等,而酵母菌在真核表达中最常用。Cao等[28]利用毕赤酵母细胞成功地表达了鸡 β – 防御素6( Av BD – 6)和脱半胱氨酸的Av BD – 6 – B生物活性肽,并在试验中发现二者均具有较强的抑菌作用。Guo等[29]同样成功地在毕赤酵母细胞中表达了抗菌肽D,该多肽具有较强的抑菌作用,抗菌肽D的酵母表达对抗菌药物的发展具有重要的指导意义。苏彩霞等[30]将乙型肝炎表面抗原( HBs Ag) 基因前连接酿酒酵母信号肽,并将整个序列优化为汉逊酵母优选密码子,通过PCR技术进行合成,最终在汉逊酵母中成功地表达了重组HBs Ag。

2. 2 多肽药物的原核表达

原核表达系统中所应用的宿主细胞包括大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌等,其中大肠杆菌为最常用的原核宿主细胞。利用原核表达重组技术,可以大量高效地合成多种生物活性多肽,即可通过设计合适的DNA模板来控制多肽的序列,为多肽药物的基因合成奠定了基础。Li等[31]在原核细胞BL21( DE3) p Lys S中成功地表达了Chicken IFN – γ,并通过体外实验证明了Chicken IFN – γ 具有较强的抗病毒活性,是原核宿主细胞应用于多肽合成的范例。Lu等[32]利用重组技术将水蛭素基因与小泛素相关修饰物( SUMO) 融合,最后在大肠杆菌中高效地表达了水蛭素( HV1) 亚型。传统的花生油提取工艺主要采用高温压榨法和有机溶剂浸提法,这两种方法由于其中的花生蛋白在高温下严重变性或者是有机溶剂的残留问题,不能够充分地被利用,张友维等[33]利用重组技术成功地在枯草芽孢杆菌中发酵制备了花生多肽,提高了花生蛋白的利用率。

3 多肽药物的其他合成方法

除上述两种多肽药物的合成方法,近年来,一些学者运用酶解法合成多肽,又称酶法多肽,即用生物酶降解蛋白质,将动植物大分子蛋白质降解成小分子活性多肽[34]。酶解蛋白质所用的酶,大多数是肽酶类。酶法多肽具有以下优点: 酶解不降低蛋白质的营养价值,可获得比原食品蛋白质更多的功能; 可保持多肽营养纯天然绿色属性,不含任何化学物质等。但酶解得到的是一系列多肽,分离纯化难度较大,因此不适于合成单一的多肽[35 – 37]。另外,肽酶的催化具有专一性,寻找合适的肽酶也是该方法的一个难点。

4 小结与展望

近几年来从自然界、机体内或化学合成中得到的多肽类药物,以其高生物活性、低毒副作用等特点引起了研究人员的高度关注,其开发前景将是十分光明的,市场潜力也不可低估。但是,作为一类新兴学科,多肽药物的体外合成同样具有一些缺点和待解决的问题。首先,化学合成中的液相合成通常较适于合成短肽,其优点是易于纯化,但缺点是费时费力,自动化程度不高; 而固相工艺恰好相反,其优点是能够实现自动化,缺点是由于每步的中间体不能纯化,粗品的纯度不如液相合成产物,需要有可靠的分离、纯化手段。其次,化学法合成多肽的过程中氨基酸的消旋化也是影响多肽合成的一个重要因素,因此研究者在多肽合成过程中要严格控制消旋化。多肽药物基因重组表达过程中不仅会表达目标多肽,还经常会引入一些杂质,如,自身表达的蛋白和多肽、缺失肽、断裂肽、氧化肽、差向异构体、侧链酰基化、二硫键交换的产物等,而很多杂质与目标肽本身的性质非常接近,因而分离和纯化工艺就显得非常复杂。因此,今后还要继续对多肽体外合成方法进行研究,以解决现阶段的不足之处,相信随着科技的进步和相关研究的飞速发展,对多肽药物体外合成方法的研究势必更加深入,对其应用亦会更加广泛。

免责声明：本文为行业交流学习，版权归 原作者所有，如有侵权，可联系删除。返回搜狐，查看更多

合肥科生景肽生物科技有限公司成立于2018年，目前已经打造了全球领先的以肽为核心的生命分子发现、合成生产、结构优化、递送平台，主要瞄准肽发现及靶向递送，专注于为各大制药企业、生物技术公司、科研单位提供一站式的定制化研发服务。 公司独有的KPDS™平台(KS-V Peptide Discovery Services Platform)是国际领先的的多肽药物发现平台，我们致力于创新药物的高效和精准开发，以科生景肽专有KPDS技术为核心，提供一站式，定制化的多肽发现服务，以灵活的产品形式和服务模式助力广大客户各类药物发现项目的快速推进和应用探究，包括但并不限于疾病诊断及保健功能产品、多肽药物、核素偶联药物(RDC)、基于小分子的肽药物偶联物（PDC)和多功能肽偶联物等。
中文官网地址：https://www.ks-vpeptide.com.cn/
英文官网地址：https://www.ks-vpeptide.com
领英：https://www.linkedin.com/company/ks-v-peptide/