摘要：综述了合成多肽疫苗的研究进展 , 系统地介绍了目前寻找抗原肽的各种方法以及各类可用作疫苗接种的合成多肽抗原的制备和应用 .

关键词： 多肽疫苗 抗原肽 佐剂

传染性疾病, 如肝炎、 流感、 疟疾和血吸虫病等病毒性或寄生虫性传染病流传很广, 遭受其感染的人群较多. 目前虽然已有化学治疗药物可以用来治疗且疗效较好, 但治愈后的再感染率很高, 在疫区需对再次感染者不停地进行治疗. 因此, 要想从根本上防治这些传染性疾病, 就必须借助于疫苗. 目前, 人们对寄生虫性和病毒性疾病的疫苗研究得较多 [1~3] . 早期的寄生虫性疾病疫苗, 如血吸虫病疫苗的研究主要集中在粉碎的血吸虫虫体疫苗、 灭活的或减毒的尾蚴或童虫疫苗, 这类疫苗虽经动物模型实验表明非常有效, 但由于来源有限, 很难进入实用阶段. 对于病毒性疾病疫苗的研究主要集中在灭活或减毒的病毒疫苗, 如脊髓灰质炎疫苗等. 这些疫苗已为人类的健康作出了巨大的贡献.

随着生物化学技术的发展, 越来越多的传染性疾病的可溶性抗原被确定出来, 它们能够诱导动物产生保护性抗体. 这些抗原通常为蛋白 (含酶) 或糖蛋白等, 可以作为疫苗的候选蛋白 [4, 5] . 为了解决这些蛋白的来源问题, 人们发展了基因工程重组疫苗 [6] , 随着分子生物学的发展, 近年来又发展了抗独特型抗体疫苗和DNA疫苗 [7, 8] .

随着免疫学的发展, 人们已经认识到有效的免疫接种意味着有免疫原性和保护性的特异抗原决定簇的参与, 因而到80年代初, Lerner [9] 提出了发展合成多肽疫苗的方法: 首先确定天然抗原 (如病毒或其亚单位) 的氨基酸序列, 并寻找抗原决定簇肽段; 然后合成抗原肽, 并试验其诱导产生抗体的能力, 选出具有免疫性和保护性的特异性抗原肽制备疫苗. 多肽抗原作为完整病毒的一部分, 不具备传染疾病的危险性, 并可以大量合成生产, 已成为未来疫苗发展的重要途径之一. 虽然一些灭活或减毒疫苗非常有效, 但其仍有引起感染的可能性, 因此, 对于危险性很大的传染病, 如爱滋病等, 人们根本不敢使用灭活或减毒疫苗. 对于这类疾病, 发展合成多肽疫苗尤为重要.

1 抗原决定簇肽段的确定

研究合成多肽疫苗最重要的一步是寻找抗原决定簇. 目前, 我们知道一种蛋白的抗原反应是可被该蛋白识别的某些免疫球蛋白与该蛋白的结合作用, 而该蛋白的结合作用区域就是其对该免疫球蛋白的抗原决定簇, 或称为抗原位点. 抗原位点是由一些起结合作用的氨基酸残基组成的, 由于这种结合作用是在三维空间进行的, 因此, 这些氨基酸残基在蛋白质的序列上可以是连续的, 也可以是不连续的, 与之相应的抗原位点就相应地称为连续抗原位点, 也称为序列抗原位点; 或不连续的抗原位点, 也称为构象抗原位点. 连续抗原通常是蛋白中的一些短的线性多肽片段, 它们可以与由完整蛋白诱导产生的抗体发生结合作用, 但由于它们通常无法保持完整蛋白的构象, 有时其结合作用可能比完整蛋白的弱. 不连续抗原是由蛋白质的多肽链通过折叠而将一些在序列上不连续的氨基酸残基带到空间的某一区域形成的, 只有当蛋白质保持固有的构象, 或至少该抗原决定簇的氨基酸残基保持原来在蛋白中的固有构象时, 该抗原决定簇才可以与和该抗原位点有结合作用的抗体发生结合作用. 但个别情况也有例外, 可与不连续抗原有结合作用的抗体中, 有约10%的抗体也可以与由不连续抗原位点的氨基酸残基组成的线性多肽产生结合作用 [2] . 下面介绍寻找抗原决定簇的方法.

1.1 酶解及化学裂解蛋白片段法

这是最早确定抗原决定簇的方法, 用酶解或化学裂解法把免疫效果好且一级结构已知的抗原分子水解成多个多肽片段, 然后测定所得多肽的抗原性和免疫原性, 从中确定出有效的抗原肽段, 用来制备疫苗. Balloul等 [10] 用V8蛋白酶降解曼氏血吸虫谷胱甘肽S-转移酶 (GST) Sm28所得到的分子量6 000和8 000的多肽可以被识别Sm 28的单克隆抗体所识别, 此二多肽可以用来制备抗曼氏血吸虫疫苗. 但用该法确定抗原位点具有较大的盲目性, 通常确定的抗原肽准确性较差, 一般偏大, 且肽序列还需测定; 另外, 从裂解混合物中分离各个多肽片段也较困难, 因此该法目前采用较少.

1.2 演绎法

为了准确找出蛋白中抗原决定簇的区域, 又发展了根据抗原蛋白中氨基酸序列分析其亲水性、 流动性和可接近性预测抗原位点的演绎法 [11~13] .

1988年Auriault等[14, 15]用演绎法研究了Sm 28的抗原肽, 推断出氨基酸残基为24-43, 115-131和140-153的3个抗原肽, 经实验证实其中24-43和115-131为IgG的主要抗原位点, 肽24-43和140-153包括对重组Sm 28抗原的T淋巴细胞特异性的主要靶点, 它们在小鼠和大鼠等动物免疫实验中可对曼氏血吸虫感染产生部分保护力.

我们也用演绎法预测了分子量为26 000的曼氏和日本血吸虫GST 3个同工酶Sm 26/1, Sm 26/2和Sj 26的抗原位点肽, 预测时还参考了它们的电荷分布和计算机预测的二级结构, 找到了7个有抗原性的肽段, 其中4个抗原性很好, 3个与BSA结合后可使小鼠免疫, 用日本血吸虫攻击可产生保护性免疫作用. 此3种同工酶的共同抗原位于该蛋白的中部105-153氨基酸残基处和靠近C端的187-202氨基酸残基处 [16~20] . 最近, 还研究了曼氏和日本血吸虫副肌球蛋白的抗原肽, 其抗原位于130-138氨基酸残基处和217-223氨基酸残基处 [21] .

1.3 化学合成肽段法

虽然演绎法可以预测蛋白质的抗原位点, 但其准确性通常只有70%~80%, 这不仅会使预测出的某些抗原位点无抗原性和免疫原性, 同时也不可避免地会使一些有效抗原位点漏掉. 近年来, 随着组合化学的发展, 在短时间内合成大量 (数以百万计) 的多肽已成为非常容易的工作, 这就促使人们开始用化学合成多肽的方法来寻找有效的抗原肽.

1.3.1 同步多针肽合成和肽扫描法

1984年Geysen [22] 及其同事首先将他们创建的多针同步多肽合成技术应用于寻找蛋白的抗原肽, 并建立了一种称为肽扫描的方法 (Pepscan) , 该法可以根据蛋白序列从N端开始向C端差一个或两个氨基酸残基选取一系列具有一定长度的多肽片段, 通常为6~10肽, 用多针技术合成这些多肽片段, 通过ELISA实验来绘制蛋白的T和B细胞位点肽谱, 以准确定出蛋白的抗原位点. 口蹄疫病毒蛋白的抗原位点就是用该法确定出来的 [23] . 对于连续抗原位点, 该法不会产生遗漏, 这就是目前使用该法来确定抗原位点的优点; 该法的缺点是要逐步合成大量的肽段来进行筛选, 工作量很大, 会造成很大的浪费.

1.3.2 光引导定位组合合成法

1991年Fodor等 [24] 以对光不稳定的保护基NVOC (6-硝基-3, 4-二甲氧基苯甲氧羰基) 保护的氨基酸作为合成肽的基元分子, 以官能团化的玻璃显微载物片为载体, 进行光引导定位组合合成, 得到连在载物片上的多肽样品, 供测定生物活性使用. 他们用该法合成了β-内啡肽 (endorphin) 的抗原位点肽及其类似物. 除玻璃外, 纸片和某些高聚物片也可用做该法的载体. 该方法是根据设计的目标分子序列预先设定合成次序及相应位置, 随后把基元分子接上去来完成的, 筛选后根据位置就可确定出所合成多肽的结构.

1.3.3 混合裂分合成法

在Furka [25] 建立混合裂分合成法进行多肽组合合成后, Lam [26] 于1991年采用该方法进行抗原肽研究, 并提出一珠一肽的概念, 他们所合成的含有近250万个五肽库对抗β-内啡肽的单克隆抗体进行了亲和性研究, 找到了天然抗原位点肽的6个有效类似物, 然后还用该肽库进行了结合抗生蛋白链菌素 (streptavidin) 的研究, 找到了一些有结合作用的肽段. 用该法确定出抗原肽, 用微量多肽测序仪即可测出该肽序列, 并能找出所有可与受体结合的有效肽段. 该法的优点是, 除可以找到蛋白的天然抗原肽外, 还可以找到其他更有效的抗原肽. 采用该方法还可以实现一个肽库对多种受体分子的筛选, 对一种受体分子筛选结束后, 用8 mol/L的盐酸胍洗掉受体络合物, 即可对另一种受体分子进行筛选.

1.3.4 编码混合裂分组合合成

Brenner等 [27] 于1992年报道了用寡聚核苷酸作编码的混合裂分组合合成, 在同一个树脂珠上以丝氨酸或苏氨酸为连接点, 合成一个多肽和一个作为编码用的寡聚核苷酸. 在合成过程中, 每3个核苷酸代表一个氨基酸残基, 同步合成到同一个树脂珠上. 对筛选出有活性的多肽, 可以通过PCR技术把与它连在同一个树脂珠上的寡核苷酸扩增, 然后用DNA序列仪读出它的序列, 从而解出目标多肽的结构.

该方法已被用于一个含数百万个五肽肽库的合成中, 并通过PCR扩增寡核苷酸, 以DNA序列仪测序推出活性多肽的序列 [28] . 该法的优点是只要用微量的编码分子寡聚核苷酸, 即可通过PCR扩增得到足够用DNA序列仪测定的量. 其缺点是在同一个树脂珠上要同时进行目标分子和编码分子的合成, 就要互相照顾反应条件,而且还需要费用较高的PCR技术及DNA测序仪等.

1.3.5 卤代芳基脂肪醇作二进制编码的混合裂分组合合成

由于核酸编码分子的不稳定性和在有机合成中的不相容性, 在对生物活性进行评估时, 它们也可能与受体分子发生作用而产生干扰, 且在合成中需要保护与脱保护等一系列不利因素而使其在应用上受到限制. 1993年Ohlmeyer等 [29, 30] 用不同的卤代芳基取代的脂肪二醇单醚制成了18个在ECGC (电子捕获毛细管气相色谱) 出峰时间不同的编码分子, 在合成过程中, 通过数学中的二进制编码方式把能够代表不同氨基酸的编码分子连接到树脂珠上, 从而达到编码组合合成的目的. 目前在编码组合合成中使用的编码分子为卤代芳基取代的脂肪二醇单醚衍生物. 该类编码分子在亚皮摩尔级就可用ECGC法检测出, 灵敏度很高. 他们用此方式将7种不同的氨基酸经过6步正交合成得到了由76=117 649个多肽组成的肽库, 并测定了抗C-MYC单克隆抗体9E10的活性, 找到了有结合作用的多肽 [29, 30] .

近年来发展的还有二级胺编码、 同位素编码、 射频标签编码、 激光光学编码和荧光团编码等编码方法 [31] .

1.4 X射线晶体结构法

抗原肽是抗原蛋白与抗体的结合部位, 由晶体结构确定该部位是比较精确的方法. 培养出抗原蛋白与抗体复合物的晶体, 用X射线衍射法测定出其结构可以准确确定抗原位点肽, 这是一种非常准确且直接的方法 [32] . 但该法受难以培养出抗原蛋白与抗体复合物晶体的限制, 因而应用不广.

2 常见合成多肽疫苗抗原

确定出抗原肽只是合成多肽疫苗研究的第一步, 研究合成多肽疫苗的关键是制备出有很好免疫原性, 而无毒副作用的多肽抗原, 并结合使用佐剂才能得到较好的免疫效果. 虽然对不同种类的疾病有不同的筛选过程及相应的筛选指标, 但由抗原肽制备的合成多肽抗原主要有以下几类.

2.1 抗原肽-载体复合抗原

合成多肽疫苗在初始阶段除了用酶法和化学法裂解后得到的较大多肽 (分子量为5 000以上) 可直接作抗原接种外, 其余均是以抗原肽-载体复合物作抗原来接种免疫的. 由于抗原肽的分子量太小, 不易产生免疫响应, 往往需要接到载体蛋白上, 以增强免疫效果. 主要是应用戊二醛等连接分子法将有效的抗原肽接到载体蛋白卵清蛋白 (OVA) 、 牛血清白蛋白 (BSA) 和破伤风类毒素 (TT) 上 [14, 23~34] .

2.2 多抗原肽抗原

抗原肽-载体复合抗原中存在载体蛋白, 载体蛋白通常为异体蛋白, 这样在接种时易引起炎症或过敏反应, 还会影响抗原肽的特异性. 由于有这些副作用, 人们开始想办法通过制备无载体蛋白来合成多肽抗原, 目前主要采用以下几种通过增加抗原肽重复次数来增加抗原分子量的方法来改进合成多肽疫苗所用抗原.

2.2.1 多聚抗原肽抗原

多聚抗原肽抗原 (图1) 是最早研究的一类无载体蛋白的合成多肽疫苗用抗原, 主要是利用缩合剂使合成的抗原肽缩合而得到抗原肽的多聚物制备的. Sm 28的24-43, 140-153在缩合剂作用下缩合成多聚物, 它们的抗原性和免疫原性均明显增加 [14, 34] . 该类抗原虽然解决了不用载体蛋白的问题, 免疫效果也得到增强, 但其结构是不确定的, 且难于重复制备成相同的多聚物.

2.2.2 串联抗原肽抗原

该类合成多肽疫苗所用抗原的制备比较简单, 主要是通过把相同的或不同的肽段串联起来以增大抗原分子的分子量实现的 (如下式) , 这可以通过在固相多肽合成时, 根据所设计的抗原肽串联后的抗原序列, 通过逐步接长合成法得到, 如重复串联3次Sm 28的115-131 [34] 及将血吸虫疫苗候选抗原磷酸丙糖异构酶TPI38的不同抗原肽P9和P18及P9和P4的串联抗原肽抗原 [35] , 但该法受到合成太长的肽段较困难的限制.

Scheme 1 Multiple antigenic peptide (MAP) antigens

2.2.3 含二硫键的链状和环状二聚体抗原肽抗原

为了增加抗原肽的分子量和免疫性, 在研制计划生育和疟疾疫苗时, 还通过在抗原肽的端基加上半胱氨酸, 再氧化后形成二硫键可以得到链状或环状抗原, 以其用作疫苗. 研究结果表明, 该类抗原也比较有效 [36~39] . 如目前已进行临床实验的疟疾疫苗SPf (66) n 即采用该类环状二聚体抗原 [38] .

2.2.4 树状多抗原肽抗原 (Dendritic Multiple Antigenic Peptides, MAP)

这是研究最多的一类合成多肽疫苗所用抗原, 主要是利用赖氨酸 (Lys) 含有两个氨基, 以它为C端, 在固相接肽时就可以它为核心合成出含有两个抗原肽的抗原; 当接n次Lys时, 就可以合成出以Lys为核心含有2n 个抗原肽的抗原, 起到了增加抗原分子量的作用. 目前研究较多的主要是以115-131为抗原肽, 分别合成了含有2,4, 8个该抗原肽的MAP抗原, 含有8个抗原肽的通常被称为“章鱼型”抗原 [34, 40] .

2.2.5 含串联抗原肽的树状多抗原肽抗原

此类抗原是结合上述两类的优点, 以Lys为核心, 以串联的抗原肽代替上述单一的抗原肽来实现的. 已见报道的有含有4个TPI38的抗原肽P18和P9串联的MAP, 含有4个P9和P18串联的MAP及含有4个P9和P4串联的MAP [35] . 以上各类抗原均可产生较好的免疫力.

2.3 多价合成多肽疫苗抗原

目前的研究大多为单一抗原肽或其多聚物的合成多肽抗原, 这仅代表一个抗原位点, 其诱导的保护力还不十分理想, 作者认为如果从不同的有效抗原分子中选出几种有效抗原肽, 再由这些代表不同抗原位点的抗原肽制成多价合成多肽疫苗, 必然会增加免疫保护力. 虽然Reynolds等 [35] 1994年报道了含有两个不同串联抗原肽的MAP, 但由于两个不同的抗原肽以串联形式连接, 串联后肽链过长, 易产生缠绕结构而影响抗原性. 作者等 [41, 42] 以Lys为核心, 通过Fmoc和Boc两种对酸碱稳定性不同的保护基的选择性, 分别以Fmoc/t-Bu和Boc/Bzl两个系列的保护氨基酸合成了以Sm 26/1和Sm 26/2的2个抗原肽S5和M4为抗原肽的多价合成多肽疫苗抗原.

3 佐 剂

佐剂也是合成多肽疫苗研究中的一个重要部分, 福氏完全和不完全佐剂均不适宜人类使用. 目前, 可以应用于人类的佐剂通常为氢氧化铝 [2, 43] . 另一个目前得到广泛研究的潜在佐剂为胞壁酰二肽及其类似物 [44, 45] , 该类佐剂可以通过共价键与抗原肽直接相连, 直接合成到抗原上, 是一类有发展前途的合成多肽疫苗用的佐剂.

总之, 合成多肽疫苗作为疫苗研究的一个方向, 目前仍处于发展阶段, 但已经取得了一些可喜的研究结果 [46~51] , 如疟疾和计划生育等的合成多肽疫苗目前已经进入一、 二期临床阶段, 在非洲的一些国家已开始试用. 目前的传染性疾病较多, 为了预防这些疾病, 人们往往需要接种多种疫苗, 由于合成多肽疫苗可以将多种疾病的有效抗原肽组装到一起, 制备成一个含有多种传染病抗原肽的抗原, 这就可以形成一种联合合成多肽疫苗. 应用联合合成多肽疫苗将可以减少接种次数, 因此, 联合合成多肽疫苗可能会成为未来合成多肽疫苗的一个重要发展方向.

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