技术分享 | 抗体抑制剂-单抗药物发展和关键技术解读(二)

单抗药物发展史

单抗药物（单克隆抗体药物）技术的发展路线可以分为几个关键阶段，以下是单抗药物技术发展的主要路线汇总：

第一代鼠源抗体-杂交瘤技术：

1975年Köhler和Milstein发明了杂交瘤技术，其中创造性的利用HAT培养基选择培养杂交瘤细胞以及使用克隆化筛选（如有限稀释法等）单克隆杂交瘤细胞，使得可以生产出特异性和纯度很高的单克隆抗体。1984年, Milstein、Köhler和发现骨髓瘤诱导产生方法的Potter被授予诺贝尔生理学或医学奖。

此时也催生出了第一代单克隆抗体药物出现，如1986年FDA批准用于人类用于预防器官移植排斥反应的单克隆抗体Muromonab-CD3（OKT3）。

这类抗体药物劣势是鼠源抗体在人体内的免疫排斥、清除乃至超敏反应；鼠源Fc不会引起人体的ADCC效应；制作周期长，需要长期免疫和筛选。目前这类抗体主要应用于研究和诊断、以及一些治疗领域。

此类单抗药物命名为：-omab

第二代人鼠嵌合抗体：

考虑到IgG的Fc（CH2/3）区域具有主要的介导效应功能（如ADCC/CDC等）以及第一代鼠源单抗的Fc缺少人体内的ADCC效应以及外源的免疫原性等因素，科学家开始尝试利用DNA重组技术用人源抗体产生基因的恒定区序列FC（如IgG的CH2/3）来代替小鼠相应抗体基因的恒定区序列（FC），保留鼠单抗的可变区序列（CDR），形成人-鼠杂合的抗体。

此种嵌合单抗蛋白的氨基酸序列约30%来自小鼠，也就是具有70%人源化，可在大幅度降低异源抗体免疫原性的同时，依然保持鼠源单抗的特异性和亲和力，同时具有人源抗体的效应功能（ADCC/CDC）。代表例子是Rituximab（利妥昔单抗，1997年FDA批准），用于治疗非霍奇金淋巴瘤Rituximab（利妥昔单抗）。

此类抗体药物劣势是可变区序列的鼠源氨基酸序列可被宿主免疫系统识别为异源蛋白而产生免疫排斥反应。

此类单抗药物命名为：-ximab

第三代人源化单克隆抗体：

在第二代单抗药物的基础上，为提高单抗的人源化，科学家想到通过基因工程技术，将鼠源单抗的互补决定区（CDRs）移植到人源框架中，制造出人源化单抗，进一步降低免疫原性。

此类抗体即为人源化单抗，其中人源序列占90%，进一步减少了抗体中异源序列含量，降低了抗体异源性。代表例子是Trastuzumab（曲妥珠单抗，1998年FDA批准），用于HER2阳性乳腺癌的治疗

。

此类抗体药物主要劣势是缺乏通用的制备方法，如每个新的治疗性抗体需要重新进行案例分析、分子建模、不断的修改和试错和对于特定的抗原分子，其对应的单抗FR并不是随意可替换的，否则会导致抗体亲和力降低；此外，此类抗体仍具有鼠源序列，不能完全避免免疫排斥或超敏反应的风险。

此类单抗药物命名为：-zumab

第四代全人源单克隆抗体：

在第三代单抗药物的基础上，同时得益于抗体工程化、基因测序等技术的发展，科学家们相继开发出了以转基因动物、噬菌体展示技术以及单细胞测序技术为核心的全人源单克隆抗体生产技术。

此类抗体即为全人源化单抗，其最小化了免疫原性，提高了耐受性和治疗窗口，适用于更广泛的患者群体。代表例子是Panitumumab（帕尼单抗，2006年FDA批准），用于治疗EGFR阳性的转移性结直肠癌。

此类抗体药物优势很多，劣势主要体现在生产成本高、技术要求高以及开发周期长上。

此类单抗药物命名为：-umab

单抗药物发展中的关键技术

杂交瘤细胞技术

+ + + + + + + + + + + 

该技术为第一代生产单克隆抗体（monoclonal antibodies，mAbs）的方法。

核心

将能够产生特定抗体的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，这些细胞既具有B细胞产生抗体的能力，又具有骨髓瘤细胞无限增殖的特性。

优势

可大量生产高特异性单抗，保留了可变区和恒定区基因组合的原生配对等。

劣势

鼠源序列的免疫性差。操作繁琐、需要动物免疫以及通常抗体含有鼠源成分等。

杂交瘤细胞技术

噬菌体展示技术（全人源）

+ + + + + + + + + + + 

噬菌体展示技术是一种利用基因重组方法，将目标蛋白的基因重组到噬菌体衣壳蛋白的基因上，使目标蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面的方法。这项技术允许在噬菌体颗粒表面表达外源（多肽）肽，通过创建噬菌体颗粒库来选择结合所需靶标的肽。

噬菌体展示中使用的噬菌体类型除了属于丝状噬菌体家族的M13噬菌体外，噬菌体展示也可以基于“尾部”噬菌体，如T7，T4和λ，以及小的ssRNA二十面体噬菌体，Qβ和MS2。

主要流程

（1）从被免疫或感染后的人体外周血单个核细胞PBMC提取细胞总RNA, 并逆转录成cDNA; 

（2）随后抗体重链可变区VH和轻链可变区VL基因片段通过PCR扩增后，随机克隆形成组合DNA文库; 

（3）将文库导入丝状噬菌体(filamentous bacteriophage)与外膜蛋白融合表达；

（4）用固相化抗原直接、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体基因序列；

（5）经体外加工形成全人源抗体。

产品

基于这些技术开发了全球第一个全人源治疗性抗体-阿达木单抗(HUMIRA®)，一种人抗肿瘤坏死因子α (TNF-α)抗体，在2002年被美国FDA批准用于治疗多种免疫介导的疾病，包括类风湿性关节炎、银屑病和克罗恩病。

优势

该技术为全新的抗体生产策略，不通过免疫动物，直接从免疫后人体获取PBMC进行，从根本上改变了传统杂交瘤技术制备流程, 一次筛选可获得针对同一抗原不同表位的多种抗体, 缩短了实验周期并增加了稳定性。此技术因为在噬菌体展示技术领域的突出贡献，美国化学家弗朗西斯·H·阿诺德、美国生物化学家乔治·P·史密斯（George P. Smith）和英国生物化学家格雷戈里·P·温特爵士在2018年被授予诺贝尔化学奖。

劣势

噬菌体表达的抗体缺少人体的蛋白修饰和折叠，一般亲和力较杂交瘤低，因此通常获得的全人源抗体需要进行人工优化。

噬菌体展示技术

酵母展示技术（全人源）

+ + + + + + + + + + + 

在噬菌体展示技术基础上，发展出了真核展示技术-酵母展示技术，实现了从原核表达系统到真核表达系统的进步。在蛋白质的折叠和分泌机制方面与高等哺乳动物相似，酵母细胞也具有折叠酶、分子伴侣、内质网等功能元件,展示的抗体具有糖基化和二硫键异构化等特点, 有助于提高展示抗体的稳定性和抗原结合能力。筛选可利用流式细胞技术, 达到高效、快速的筛选和分离。

产品

如2018年在中国批准靶向PD-1治疗噬血细胞性淋巴组织细胞增多症（HLH）霍奇金淋巴瘤的Sintilimab。

优势

获得部分蛋白修饰，且通过微生物发酵可大量获取抗体，成本低。

劣势

酵母的修饰系统与人体依然有不小的差异，抗体功能有一定影响。

酵母表面展示概述

哺乳动物细胞展示技术（全人源）

+ + + + + + + + + + + 

随后就想到了使用哺乳动物细胞获得类似人体细胞内修饰的抗体，而中国仓鼠卵巢(Chinesehamster ovary, CHO)细胞是一种目前用于真核基因表达的最成功的哺乳动物细胞。与噬菌体展示技术相比, 外源蛋白不仅更易合成和分泌到培养基中，而且能够正确折叠、修饰、组装多亚基蛋白, 以及理化性质、生物学性质几乎与天然蛋白相似, 这在生物技术的发展中具有很高的应用价值。

优势

表达全长抗体、高准确性的蛋白质折叠和翻译后修饰等。

劣势

哺乳动物细胞生长周期长，升本高；展示库容量小于噬菌体；外源DNA转染难度，特别是较难保证只有一种外源DNA进入单个细胞。

哺乳动物表面展示技术示意图

核糖体展示技术（全人源）

+ + + + + + + + + + + 

核糖体展示技术，由Plückthun实验室于1997年建立，是一种创新的蛋白质工程技术，它通过PCR扩增淋巴细胞cDNA中的VH和VL基因，并引入体外表达元件来构建文库。这一过程允许在体外无细胞体系中进行转录和翻译，从而实现对抗体文库的高效筛选。

原理

在构建模板时，3端序列不包含终止密码子，使得体外翻译过程中核糖体停留在mRNA的3端，将文库基因的翻译产物展示在核糖体表面，形成“蛋白质-核糖体-mRNA”三元复合物。通过使用靶抗原反复筛选这些复合物、分离mRNA、逆转录富集目的基因，最终获得特异性的单克隆抗体序列。

优势

体外进行抗体的快速筛选和优化，缩短了研发周期；允许在不依赖活细胞的情况下进行抗体的高通量筛选，降低了生产成本；以及核糖体展示技术可以生成多样化的抗体库，增加了发现高亲和力和高特异性抗体的机会。

劣势

体外环境中无法完全模拟体内条件，导致筛选出的抗体在实际应用中表现不佳；需要复杂的设备和专业的技术人员进行操作等。

核糖体展示技术

转基因小鼠（全人源）

+ + + + + + + + + + + 

因各种抗体展示技术展示的文库多样性不足和抗原使用等的限制，导致抗体亲和力人不够高，所以出现了一种体内获得全人源抗体的需求，也即转基因小鼠获得全人源单抗。

原理

在鼠胚胎干细胞中进行同源重组使得鼠的原有抗体基因缺失,再通过介导外源DNA转移等技术（如显微注射、逆转录病毒载体、酵母人工染色体系统或者精子介导外源DNA转移等）将重建的人源抗体胚系基因位点转入小鼠体内,最终由杂交瘤技术或者抗体库技术筛选出靶向的单克隆抗体。HuMAb-Mouse 与XenoMouse 是目前最为成熟的转基因小鼠技术平台。

产品

Panitumumab (Vectibix)-靶点为EGFR、治疗转移性结直肠癌、2006年FDA批准上市；Denosumab (Prolia, Xgeva)-靶点RANKL、治疗骨质疏松症和骨转移癌、2010年FDA批准上市等。

优势

能够精确地操控小鼠的基因组，使其表达特定的人类抗体，从而提高抗体的亲和力和特异性；转基因小鼠能够快速生成大量的抗体，缩短了药物开发的时间。

劣势

尽管小鼠模型在许多方面与人类相似，但仍然存在生理和免疫系统上的差异，无法产生和人体完全一致的抗体；抗体多样性低, 对小分子化合物免疫原性较弱, 不适合针对生物毒素等对机体有害的人源抗体的制备以及所制备的抗体含有鼠糖基化修饰等；转基因小鼠的开发和维护需要复杂的技术和设施，初期投入较高等。

转基因小鼠技术

单细胞抗体基因扩增技术（全人源）

+ + + + + + + + + + + 

随着高通量测序及流式细胞术的普及和发展，单细胞技术在生产人源化抗体方面应用广泛。

过程

从患者或接种疫苗人群的外周血中根据抗原和细胞表面标记物筛选出单个B细胞，再利用逆转录PCR和巢式PCR直接获得抗体轻重链基因，将这些基因克隆并在真核系统中表达。

优势

能快速、直接地获得人源抗体, 特别适合在突发传染病等情况下发现有保护性的单克隆抗体；只需少量细胞就可以快速高效地筛选出潜在的抗体轻重链天然配对的单克隆抗体，在新发、突发传染病等紧急事件中，可以快速获得针对病原微生物的高亲和力抗体。

劣势

决定性的影响因素多样，如抗原标记、抗原分类(如单体、二聚体乃至四聚体)和引物组的设计都是成功筛选单克隆抗体的重要因素。

单抗生产的单细胞技术

各种单抗药物的表面显示系统的类型

欢迎购买APExBIO的高性能、高纯度抗体抑制剂产品。

https://www.apexbio.cn/biochemical-reagent/inhibitory-antibodies.html 

参考文章

向下滑动阅览

[1]Sharma P, Joshi RV, Pritchard R, Xu K, Eicher MA. Therapeutic Antibodies in Medicine. Molecules. 2023 Sep 5;28(18):6438. doi: 10.3390/molecules28186438. PMID: 37764213; PMCID: PMC10535987.

[2]Christer Wingren, Ulf Alkner, Ulla-Britt Hansson. Antibody Classes. 2005 Sep 23, https://doi.org/10.1038/npg.els.0003985.

[3]Castelli MS, McGonigle P, Hornby PJ. The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies. Pharmacol Res Perspect. 2019 Dec;7(6): e00535. doi: 10.1002/prp2.535. PMID: 31859459; PMCID: PMC6923804.

[4]Vidarsson G, Dekkers G, Rispens T. IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. Front Immunol. 2014 Oct 20; 5:520. doi: 10.3389/fimmu.2014.00520. PMID: 25368619; PMCID: PMC4202688.

[5]Yu J, Song Y, Tian W. How to select IgG subclasses in developing anti-tumor therapeutic antibodies. J Hematol Oncol. 2020 May 5;13(1):45. doi: 10.1186/s13045-020-00876-4. PMID: 32370812; PMCID: PMC7201658.

[6]Adams GP, Weiner LM. Monoclonal antibody therapy of cancer. Nat Biotechnol. 2005 Sep;23(9):1147-57. doi: 10.1038/nbt1137. PMID: 16151408.

[7]Scott AM, Wolchok JD, Old LJ. Antibody therapy of cancer. Nat Rev Cancer. 2012 Mar 22;12(4):278-87. doi: 10.1038/nrc3236IF: 78.5 Q1 . PMID: 22437872.

[8]Chiu ML, Gilliland GL. Engineering antibody therapeutics. Curr Opin Struct Biol. 2016 Jun; 38:163-73. doi: 10.1016/j.sbi.2016.07.012. Epub 2016 Aug 12. PMID: 27525816.

[9]Wang Z, Wang G, Lu H, Li H, Tang M, Tong A. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Mol Biomed. 2022 Nov 22;3(1):35. doi: 10.1186/s43556-022-00100-4. PMID: 36418786; PMCID: PMC9684400.

[10]Alejandra WP, Miriam Irene JP, Fabio Antonio GS, Patricia RR, Elizabeth TA, Aleman-Aguilar JP, Rebeca GV. Production of monoclonal antibodies for therapeutic purposes: A review. Int Immunopharmacol. 2023 Jul;120:110376. doi: 10.1016/j.intimp.2023.110376. Epub 2023 May 25. PMID: 37244118.

[11]Weiner GJ. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nat Rev Cancer. 2015 Jun;15(6):361-70. doi: 10.1038/nrc3930IF: 78.5 Q1 . PMID: 25998715; PMCID: PMC4491443.

[12]Beigel JH. Polyclonal and monoclonal antibodies for the treatment of influenza. Curr Opin Infect Dis. 2018 Dec;31(6):527-534. doi: 10.1097/QCO.0000000000000499. PMID: 30299360.

[13]Posner J, Barrington P, Brier T, Datta-Mannan A. Monoclonal Antibodies: Past, Present and Future. Handb Exp Pharmacol. 2019;260:81-141. doi: 10.1007/164_2019_323. PMID: 31820172.

[14]Shepard HM, Phillips GL, D Thanos C, Feldmann M. Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins. Clin Med (Lond). 2017 Jun;17(3):220-232. doi: 10.7861/clinmedicine.17-3-220IF: 4.4 Q2 . PMID: 28572223; PMCID: PMC6297577.

[15]Grilo AL, Mantalaris A. The Increasingly Human and Profitable Monoclonal Antibody Market. Trends Biotechnol. 2019 Jan;37(1):9-16. doi: 10.1016/j.tibtech.2018.05.014IF: 17.3 Q1 . Epub 2018 Jun 23. PMID: 29945725.

[16]Ecker DM, Jones SD, Levine HL. The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs. 2015;7(1):9-14. doi: 10.4161/19420862.2015.989042IF: 5.3 Q2 . PMID: 25529996; PMCID: PMC4622599.

[17]Maecker H, Jonnalagadda V, Bhakta S, Jammalamadaka V, Junutula JR. Exploration of the antibody-drug conjugate clinical landscape. MAbs. 2023 Jan-Dec;15(1):2229101. doi: 10.1080/19420862.2023.2229101IF: 5.3 Q2 . PMID: 37639687; PMCID: PMC10464553.

[18]Niquille DL, Fitzgerald KM, Gera N. Biparatopic antibodies: therapeutic applications and prospects. MAbs. 2024 Jan-Dec;16(1):2310890. doi: 10.1080/19420862.2024.2310890. Epub 2024 Mar 4. PMID: 38439551; PMCID: PMC10936611.

[19]Brinkmann U, Kontermann RE. The making of bispecific antibodies. MAbs. 2017 Feb/Mar;9(2):182-212. doi: 10.1080/19420862.2016.1268307IF: 5.3 Q2 . PMID: 28071970; PMCID: PMC5297537.

[20]Hansel TT, Kropshofer H, Singer T, Mitchell JA, George AJ. The safety and side effects of monoclonal antibodies. Nat Rev Drug Discov. 2010 Apr;9(4):325-38. doi: 10.1038/nrd3003IF: 120.1 Q1 . Epub 2010 Mar 22. PMID: 20305665.

[21]Nagano K, Tsutsumi Y. Phage Display Technology as a Powerful Platform for Antibody Drug Discovery. Viruses. 2021 Jan 25;13(2):178. doi: 10.3390/v13020178. PMID: 33504115.

[22]Jaroszewicz W, Morcinek-Orłowska J, Pierzynowska K, Gaffke L, Węgrzyn G. Phage display and other peptide display technologies. FEMS Microbiol Rev. 2022 Mar 3;46(2):fuab052. doi: 10.1093/femsre/fuab052IF: 11.3 Q1 . PMID: 34673942IF: 11.3 Q1 .

[23]Valldorf B, Hinz SC, Russo G, Pekar L, Mohr L, Klemm J, Doerner A, Krah S, Hust M, Zielonka S. Antibody display technologies: selecting the cream of the crop. Biol Chem. 2021 Mar 23;403(5-6):455-477. doi: 10.1515/hsz-2020-0377. PMID: 33759431.

[24]Zhang Y. Evolution of phage display libraries for therapeutic antibody discovery. MAbs. 2023 Jan-Dec;15(1):2213793. doi: 10.1080/19420862.2023.2213793. PMID: 37222232; PMCID: PMC10210849.

E

N

D

关于APExBIO

– 滑动查看更多介绍 –

    APExBIO是一家集研发、销售和技术服务为一体的高新技术企业，总部位于美国休斯顿。APExBIO的产品涵盖肿瘤、免疫、神经等热门生物医药领域研究所需的小分子抑制剂/激动剂，高通量化合物库，细胞分子检测试剂等；作为国内领先的mRNA体外转录合成平台供应商，我们提供各种体外合成mRNA所需的修饰核苷酸、转录酶等原料，并可提供mRNA定制服务及LNP包被服务；此外，APExBIO技术服务部致力于提供组学检测与质控、生信分析及结果解读等一站式科研外包服务，包括单细胞、转录、微生物、蛋白、代谢以及表观等多组学实验和药物发现服务，广泛应用于药物研发、个性化医疗、健康管理等领域，为全球科研人员提供突破性的研究工具。

      迄今为止，APExBIO已服务全球2000+用户，5000+重要科研项目，助力Immunity、Nature等300+ CNS国际顶尖学术期刊文章的发表。我们以专业的团队和卓越的技术，不断提升服务质量和客户满意度，为全球科研事业的发展贡献力量。

合肥科生景肽生物科技有限公司成立于2018年，目前已经打造了全球领先的以肽为核心的生命分子发现、合成生产、结构优化、递送平台，主要瞄准肽发现及靶向递送，专注于为各大制药企业、生物技术公司、科研单位提供一站式的定制化研发服务。 公司独有的KPDS™平台(KS-V Peptide Discovery Services Platform)是国际领先的的多肽药物发现平台，我们致力于创新药物的高效和精准开发，以科生景肽专有KPDS技术为核心，提供一站式，定制化的多肽发现服务，以灵活的产品形式和服务模式助力广大客户各类药物发现项目的快速推进和应用探究，包括但并不限于疾病诊断及保健功能产品、多肽药物、核素偶联药物(RDC)、基于小分子的肽药物偶联物（PDC)和多功能肽偶联物等。
中文官网地址：https://www.ks-vpeptide.com.cn/
英文官网地址：https://www.ks-vpeptide.com
领英：https://www.linkedin.com/company/ks-v-peptide/