单克隆抗体（mAbs）是一类重要的治疗药物，其成功得益于高通用性、高靶标特异性、良好的临床安全性和疗效。治疗性抗体的发现是抗体开发流程的最上游阶段，对抗体产品的临床结果起着关键作用。噬菌体展示技术为治疗性抗体的发现提供了一种高度通用的方法，克服了体内抗体发现方法的许多局限性，已有许多获批的mAbs来源于该技术。
图1. 抗体噬菌体展示文库的类型（左上角）、文库构建（左下角）和抗体筛选（右侧）。根据多样性的来源，抗体噬菌体展示文库可分为三类：天然文库、合成文库和半合成文库。在典型的噬菌体系统中，轻链和重链的可变区，既可以从天然免疫球蛋白库中克隆，也可以在体外设计和合成，然后克隆到噬菌体展示载体（噬菌体）中，其中一条链与噬菌体的pIII蛋白融合显示。文库池随后转化到大肠杆菌宿主细胞中。通过辅助噬菌体感染，提供所有噬菌体生产的成分，生成噬菌体文库。以固相淘选为例，噬菌体文库与固定化抗原孵育。洗涤后，非特异性噬菌体被去除，抗原特异性噬菌体与抗原结合。结合的噬菌体通过不同方法从抗原中解离，例如低pH洗脱、酶切割。最后，洗脱的噬菌体在大肠杆菌宿主细胞中增殖。经过反复淘选，抗原特异性克隆被富集。通常，中后期淘选输出的噬菌体会进行测序和结合特性鉴定，以获得序列多样性和高亲和力。
01噬菌体展示
原理：将外源肽展示在噬菌体表面，通过淘选和基因提取来筛选具有所需特性的蛋白质变体。
抗体片段格式：包括单链可变片段（scFv）、抗原结合片段（Fab）、单域抗体（VHH）和双特异性抗体片段等。
噬菌体选择：常用的淘选策略有固相和液相淘选，还包括其他策略如基于细胞和纳米盘的淘选等，功能选择也可直接整合到筛选过程中。
噬菌体M13：是最广泛用于噬菌体展示的丝状噬菌体，其感染宿主细胞通过与宿主F菌毛和噬菌体小外壳蛋白pIII的特定相互作用，pIII常用于与抗体融合。
02三代抗体噬菌体展示库
第一代库：通过扩增小鼠抗体库的轻重链可变区域构建了Fab库，证明了抗体发现可以完全在体外进行，且能直接从噬菌体库中分离出高亲和力和序列多样性的抗体。
第二代库：以一些半合成和全合成库为代表，在设计中基于对天然抗体结构和抗体 – 抗原相互作用的了解，精心选择氨基酸分布和多样化的位置，并考虑了可开发性，如HuCAL系列库和Dyax库等。
第三代库：通过体外或体内实验方法进一步提高了库的整体质量，使其产生的抗体具有与治疗性抗体药物相当的特性，如ALTHEA Gold库和通过酵母展示过滤构建的库。
03针对特定应用设计的库
GPCR库：GPCR是一类具有挑战性的靶标，噬菌体展示为其提供了有价值的抗体发现平台，如通过挖掘GPCR配体相互作用序列设计的合成抗体噬菌体展示库。
选择pH依赖抗体的库：通过在CDRH3中富集组氨酸残基并结合修饰的筛选策略，从合成抗体噬菌体展示库中分离出具有pH依赖结合特性的抗CXCL10抗体。
具有延长CDRH3的库：一些物种的抗体具有天然延长的CDRH3，提供了额外的多样性和抗原结合复杂性，通过构建携带延长CDRH3的合成Fab噬菌体展示库，发现了能有效抑制基质金属蛋白酶 – 14的抗体。
04结论
噬菌体展示技术已经成功应用于抗体发现，目前已有17种获批的单克隆抗体（mAbs）以及更多处于临床研究阶段的噬菌体衍生抗体。亲和力是评估噬菌体库质量的关键因素，其与库大小呈正相关，但与库类型或代数无明显相关性。为增加功能性库大小，可采用抗标签抗体进行校对淘选等策略，同时应考虑框架的使用，避免选择某些重链种系基因。与体内抗体发现方法相比，噬菌体展示的另一个优势是能够快速检索序列信息，NGS和机器学习的应用有助于挖掘潜在的有趣序列和预测结合特征。尽管噬菌体展示有许多优点，但体外衍生的mAbs的可开发性一直是个问题，第三代噬菌体展示库通过整合体外或真核质量控制步骤来解决这个问题，也可通过哺乳动物展示来进一步筛选或优化mAbs的可开发性。随着噬菌体展示技术的不断发展以及与其他先进技术的结合，它将继续为创新药物发现做出巨大贡献。
参考文献：Zhang Y. Evolution of phage display libraries for therapeutic antibody discovery. MAbs. 2023 Jan-Dec;15(1):2213793. doi: 10.1080/19420862.2023.2213793. PMID: 37222232; PMCID: PMC10210849.
原文下载链接：Evolution of phage display libraries for therapeutic antibody discovery.pdf
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