前言抗体发现在现代医学几乎所有领域中变得越来越重要，目前存在很多抗体发现的方法，其中噬菌体展示技术（phage display technology）就是其中最重要的技术之一。其原理是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段插入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合，本文将从噬菌体展示技术原理、噬菌体展示平台应用、scFv文库构建及筛选等方面展开论述。
噬菌体展示技术发展及原理George Smith于1985年证明了噬菌体展示技术（phage display technology），他成功地将外源DNA整合到M13噬菌体的染色体中，使外源多肽融合到M13噬菌体的G3P外壳蛋白中【1】，5年后，在John McCafferty andGregory Winter等人的开创性工作之后，他们能够将编码整个抗体结合域的基因(以单链可变片段的形式，scFvs)融合到基因III中，并构建了许多噬菌体展示抗体文库【3】。自1990年以来，不同的抗体形式已被用于构建抗体噬菌体展示文库，包括人重链抗体片段(VHs)、重链骆驼和鲨鱼抗体片段(VHHs)、scFvs、diabodies(二价scFvs)和Fab抗体片段【3-7】，噬菌体展示技术已经在蛋白质工程领域掀起了一场革命，对抗体工程发展具有深远影响，其方法学的快速发展是第一个有力的突破，使其成为最成功的基于抗体药物工程技术的平台之一【1
】。
图1 M13噬菌体对大肠杆菌的感染过程
噬菌体的G3P与F菌毛的顶端结合，随后正常分解变短的F菌毛将噬菌体运送到细菌表面，与TolA受体相互作用，介导噬菌体基因组的摄取【2】。
G3P基因融合到一个人类单链可变片段(scFv)与胰蛋白酶切割位点显示为黄色部分作为连接肽连接两个蛋白质。
图3 以天然全人源scFv展示为例论述噬菌体展示过程
噬菌体展示平台应用噬菌体展示平台近年来被广泛用于抗体药物工程、细胞免疫治疗等方面，但是在过去几十年这项技术受限于其专利限制，导致只有少数公司拥有这项技术，随着近几年该项技术的专利纷纷到期，使得该技术的相关研发得到快速推进，我们大家所熟知的药王阿达木单抗（adalimumab，修美乐）就是一个很好的例子，此药于2002
年上市以来，每年在全球的销售额都遥遥领先，下面我们来盘点一下那些出自噬菌体展示技术的抗体药。
噬菌体展示技术在抗体发现和优化中具备高通量、效率高、周期短、成本低等独特的优势，在未来出自此技术的抗体药也将会越来越多。
噬菌体展示scFv文库构建及筛选首先，噬菌体展示抗体文库的构建及筛选是一个系统性的工程性实验，二者具有极其紧密的联系，因为只有高质量（库容量足够大、多样性足够多、阳性率足够高、每一步实验过程中损失量足够小）的抗体文库才是筛选到理想抗体最重要的保障，所以说评价一个抗体库质量如何，最重要的指标是能从文库里筛选到具有成药性或研究价值的抗体。其次，建库过程中把握好每一个实验细节很重要，细节一：分离PBMC的质量，总RNA提取质量，cDNA逆转录合成质量；细节二：第一轮PCR扩增质量（抗体基因引物设计覆盖全面，VH/VK/VL特异性好），第二轮PCR扩增质量（VH/VK/VL特异性好），第三轮PCR扩增质量（拼接完全，VH+VK、VH+VL特异性好）；细节三：scFv片段与噬菌粒载体酶切完全，连接实验保证效率最高（一般以化学转化小试检测）；细节四：电击转化的关键是感受态细胞的制备，高质量的感受态细胞（菌株无污染、菌株活性高、无盐离子）是多样性多、库容量大、阳性率高的关键因素。最后，文库包装也值得我们重视，细节五：包装的菌液要充分混匀，保证包含这个库的全部多样性，辅助噬菌体（helper phage）的加入量应适宜（根据菌液OD值代入公式计算）；细节六：因为整个文库构建步骤较多，且每一步（如样品胶回收、酶切产物回收、连接产物纯化等
）都要尽可能的减少实验样品的损失，才能保证更多的多样性。
图4 噬菌体展示技术构建全人源scFv抗体文库流程图
（图片来源于成都仁域生物）
综上所述，我们带大家从噬菌体展示技术的原理，近年来噬菌体展示技术平台在抗体药物研发领域的应用及以噬菌体展示全人源scFv抗体文库构建的细节等方面回顾了噬菌体展示技术（phage display technology），自20世纪80年代第一个抗体药物（Muromonab-CD3）获批以来，全人源抗体与人源化抗体得到了加速发展，渐渐成为抗体药物研发的重要方向，在此过程中噬菌体展示技术得到了广泛的应用，因为这项技术在传统的杂交瘤技术面前有着非常突出的优势。
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参考文献
【1】Smith, G.P. Filamentous fusion phage: Novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 1985, 228, 1315–1317. [CrossRef] [PubMed]
【2】Line Ledsgaard，Mogens Kilstrup，Andreas H. Laustsen. Basics of Antibody Phage Display Technology. Toxins 2018, 10, 236, 3-5.
【3】McCafferty, J.; Griffiths, A.D.; Winter, G.; Chiswell, D.J. Phage antibodies: Filamentous phage display ingantibody variable domains. Nature. 1990, 348, 552–554. [CrossRef] [PubMed]
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