1． 噬菌体与噬菌体展示技术的发明
从字面含义上看，噬菌体是指能“吃掉”细菌的病毒，即一类能感染细菌、真菌、放线菌及螺旋体等微生物的病毒的总称。噬菌体的体积很小，形态因种类不同而存在差异，一般多为蝌蚪形，也可呈微小的球形或细长杆状。大多数噬菌体为有尾巴的二十面体结构（图1），也有部分噬菌体没有尾部结构。其中，衣壳蛋白规律排列组成了噬菌体二十面体的头部，其中含有遗传物质——核酸。而丝状噬菌体外形呈线状，没有明显的头部结构，其衣壳蛋白颗粒组成的盘旋状结构形成了外壳，包裹着噬菌体的核酸。 目前，根据基于病毒基因测序的噬菌体蛋白组树分类法，可将噬菌体分为光滑噬菌体、囊状噬菌体、丝状噬菌体、微小噬菌体、短尾噬菌体、长尾噬菌体、肌尾噬菌体和Fuselloviridi等8种（表1）。
1915年英国微生物学家托特（FederickWilliamTwort）首先在金黄色葡萄球菌的培养中，观察到了噬菌体杀死细菌的现象。作为细菌的天敌，噬菌体很快就被用于对抗细菌感染的治疗中。 1919年，人们采用噬菌体疗法在法国治疗儿童痢疾取得了成功。后来人们又相继发现，噬菌体可感染霍乱弧菌和炭疽芽孢菌等多种病原细菌，并可将这些宿主病原菌裂解，成为治疗这些病原菌感染相关疾病的特效药物，成为抗感染治疗的有效方法之一。 随着抗生素的发明和使用，利用噬菌体进行治疗细菌感染的方法一度陷入低谷。但进入21世纪以来，因为细菌对抗生素产生耐药的问题越来越严重，噬菌体治疗再次进入了人们的视野，并在耐药细菌和条件性致病细菌感染的治疗中取得了初步的胜利。 噬菌体成为2018诺贝尔化学奖的关键词，却不是因为其抗菌的作用，而是因为有人将其变成了能够展示外源性基因片段编码蛋白及其功能的“展柜”。 1985年，乔治·史密斯首先在Science杂志上发表了题为《丝状融合噬菌体：可以在病毒表面表达克隆抗原的新表达载体》的文章（图2）。这标志着一种可用于大规模高通量蛋白质之间相互作用研究（特别进行抗原表位和特异性抗体的筛选与鉴定）的新型表达载体系统诞生了。在此基础上，以格雷戈里·温特爵士为代表的科学家将其应用于抗体的人源化改造等生物学领域的研发中，极大推进了疫苗和基因工程化抗体等新型生物制品研发的进展，使抗体技术在继杂交瘤技术和嵌合抗体技术之后，进入了第3次技术革命阶段，越来越多的抗体药物逐渐进入了临床治疗应用的选择范围中。这也是温特尔爵士能成为本次诺贝尔化学奖分享者的充分理由。2 噬菌体展示技术的原理及常用系统类型 为什么小小的噬菌体能成为展示各种外源性蛋白片段，以及成为筛选抗原表位和特异性抗体的好工具？ 原来，人们可通过基因工程技术，将噬菌体中编码衣壳蛋白信号肽的基因和衣壳蛋白多肽的基因切开，将编码外源性多肽或蛋白质的基因片段插入到二者之间，从而使外源性的多肽或蛋白质序列与噬菌体衣壳蛋白形成融合蛋白分子，在信号的引导下，表达于噬菌体的表面。此过程称为“展示”。
由于噬菌体体积微小，表达在其表面被展示出来的外源性多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构及生物学活性，从而可通过适当的淘选方法得到与靶分子亲和性最强的可结合序列，并用于各种筛选、鉴定及生物学功能的研究与实践中。 迄今为止，人们已开发了丝状噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统，以及λ噬菌体展示系统等多种不同的噬菌体展示系统。 丝状噬菌体展示系统是最早被发明和应用的噬菌体展示体系。丝状噬菌体的基因编码pⅧ、pⅢ、pⅥ、pⅦ和pⅨ等5个衣壳蛋白，其中pⅧ和pⅢ是最常用的展示蛋白。丝状噬菌体载体较为稳定，但转化效率较低。如果展示的蛋白片段过大，则会进一步降低pⅢ蛋白与大肠杆菌的性纤毛之间的相互作用，使其感染宿主大肠杆菌的能力进一步下降，需要通过应用辅助噬菌体等方法进行改善。 T4噬菌体展示系统是一种比较常用的展示系统。在进行展示的时候，人们一般将外源性蛋白片段与T4生命非必需衣壳蛋白SOC和HOC融合，这2个蛋白分布于噬菌体的正二十面体表面，具有很多拷贝，且不影响T4噬菌体的衣壳组装，是良好的展示蛋白结构。同时，T4噬菌体基因组为线性双链DNA，在宿主细胞内组装成为病毒颗粒。在此过程中，展示蛋白不需要通过质膜和细胞分泌过程，因此，可广泛应用于包括不能被大肠杆菌分泌的复杂蛋白在内的各种多肽和蛋白质的展示研究。 λ噬菌体具有两端不闭合的线形双链DNA组成的基因组，外源性多肽或蛋白质主要基于其头部的D蛋白和尾部的V蛋白进行展示，这2个蛋白在噬菌体上的拷贝数分别为405～420和192个，能对外源性多肽或蛋白质进行多拷贝的表达。λ噬菌体不仅在宿主细胞内完成组装，无需分泌过程，且该系统还能展示100kD以上的活性蛋白大分子及对宿主细胞具有毒性蛋白质。同时，凭借D蛋白的分子伴侣作用，λ噬菌体系统还能在大肠杆菌等原核细胞中，高水平表达和展示多种具有生物学活性的真核细胞蛋白质。 例. 利用噬菌体展示技术可以筛选到高亲和力的抗体，研究人员首先将禽流感抗体的轻、重链结合区改造成单链抗体片段基因，将其插入到丝状噬菌体DNA中，与噬菌体表面的结构蛋白（pIII）形成融合蛋白，选用相应抗原筛选高亲和力的单链抗体片段，用于后续改造和表达。请根据信息回答以下问题：
（1）构建噬菌体展示文库时，可将目的基因插入到__________基因旁形成融合蛋白基因。为使目的基因与载体有相同的酶切位点，可利用PCR技术，在目的基因右侧的引物中人工合成__________限制酶的识别序列，本实验优先考虑使用__________酶进行噬菌体展示表达载体的连接。
（2）将构建好的重组截体导入__________细胞中表达筛选前，通常先将受体细胞处理成__________细胞的状态，再借助电击等方法导入表达载体，进而获得表达产物。
（3）上述经过筛选得到的禽流感抗体与康复者体内筛选得到的抗体不完全相同，原因很可能是___________________________________
（4）为了与人体内抗体的结构和活性一致，还需将上述抗体基因在哺乳动物细胞中表达和筛选。在培养动物细胞表达抗体的过程中，通常需要向合成培养基中添加__________或血浆等天然成分，然后将培养皿放置于__________中，以维持37℃与5%的CO2等条件。培养一段时间后可以利用__________的原理，从上清液中检测是否有目标抗体表达。
（5）扩大培养时，为避免出现__________的现象，当细胞铺满培养皿约80%左右时，应使用__________酶等处理，然后传代培养。
答案:（1）噬菌体蛋白III Not I（2分） T4 DNA连接酶（2分）（2）大肠杆菌 感受态（3）噬菌体抗体库技术借由大肠杆菌进行表达、筛选，原核细胞不含内质网和高尔基体，无法对抗体进行正确的加工修饰。（2分）（4）血清 CO2培养箱 抗原-抗体反应（5）接触抑制 胰蛋白酶或胶原蛋白酶
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