免疫印迹(Western Blot)的基本原理、实验步骤

原理

Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。SDS-PAGE可对蛋白质样品进行分离，转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜（NC）上。固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的NC膜就称为一个印迹（blot），用蛋白溶液（如5%BSA或脱脂奶粉溶液）处理，封闭NC膜上的疏水结合位点。用目标蛋白的抗体（一抗）处理NC膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。用一抗处理过的NC膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。

PVDF膜

Western Blot实验试剂及仪器

1.试剂准备

（1）甲醇

（2）转移缓冲液（Tris5.8g 甘氨酸2.9g SDS 0.37g 甲醇200ml V=1L）

（3）一抗，二抗

（4）PBST，PBS，Tween-20

（5）显影液（5X）：

自来水（加热至 50℃） 375ml （以下药品加到温水中）

米吐尔 1.55g， 亚硫酸钠（无水） 22.5g， 碳酸钠（无水） 33.75g， 溴化钾 20.95g，补水至 500ml

（6）定影液：

自来水（50～60℃） 700ml （以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）

硫代硫酸钠 240g， 亚硫酸钠（无水） 15g， 冰乙酸 12.6ml，硼酸 7.5g，钾明矾 15g（水温冷至 30℃以下时再加入），加水定容至 1000ml，室温保存

2. 材料准备

转膜用的夹子，两块海绵垫，一支滴管，两张滤纸，一张PVDF膜，转膜槽，转移电泳仪，摇床，计时器，磁力搅拌器，转子，Western blot 盒，一块SDS-PAGE胶，脱脂奶粉

A：电泳分离蛋白质，由裂解细胞或组织制备目的蛋白质样品，经SDS-PAGE电泳处理后，不同分子质量大小的蛋白质得到分离。

B：转膜，将电泳分离的条带从凝胶转移至NC/PVDF膜上。常用的方法是电洗脱或电泳转移，形成“负极-海绵-三层滤纸-胶-膜-三层滤纸-海绵-正极”转膜结构，在施加电场后蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶中移出并吸附在膜表面。

C：抗体孵育，用目标蛋白的抗体（一抗）处理膜，漂洗除去未结合的抗体，膜上仅含有目标蛋白结合的一抗。再用标记的二抗进行酶免疫定位。

D：显影分析，用x-ray底片曝光，根据信号的强弱调整曝光时间或不同时间多次压片以达到最佳效果。曝光完成后取出x-光片迅速浸入显影液中显影，待条带明显后停止显影，分析结果。

实验注意事项

转膜：转膜时滤纸与胶、胶与膜、膜与滤纸之间不能有气泡，否则会影响转膜的效果。膜封闭：转好的膜用TBST润洗两次， 再用5%脱脂奶粉溶液(TBST配制)常温封闭一至两小时，抑制抗体非特异性吸附膜上未反应的位点。抗体的选择：免疫实验中标记的二抗是检测靶抗原的最终手段。如果一抗是未修饰的小鼠单克隆抗体，二抗必须是从非小鼠宿主获得的抗小鼠IgG第二抗体。洗涤缓冲液：实验中通过洗涤去除未结合的试剂并降低背景，增加信噪比。洗涤不充分会导致高背景；洗涤过度会使抗原/抗体从印迹中洗脱导致敏感性降低。显影和定影：移动时尽量手拿胶片一角避免划伤影响结果。

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