来源：博药公众号
学术界与工业界之间通常存在“时差”，学术界使用的方法，在工业界往往还未普及，多肽化学领域也未除外，如果说存在能够同时引发多肽化学在学术界和工业界这两大领域的热点，绿色溶剂大概算得上是一个了。
01
固相多肽合成的黄金溶剂不再“黄金”？
绿色化学的概念在最近十年深入人心，随着人们对于寻求生态环境的保护、可持续性发展，与工业生产之间的平衡，绿色溶剂成了业内人士的共识。作为固相多肽合成（SPPS）的黄金溶剂，DMF（图1）因为强大的溶解能力与多肽树脂溶胀能力，成了几十年来SPPS绝对的标准溶剂。
图1. DMF 化学结构
图片来源：使用chemdraw绘制
而DMF内在的危害性逐渐为行业所警惕。它的健康影响包括肝毒性和男性生殖毒性，可能与线粒体 DNA (mtDNA) 改变有关；DMF在体内的生物转化过程中会形成自由基，包括羟基自由基。据公开数据，2001 年全球 DMF 消费量约为 285000 吨，其中大部分用作工业溶剂。
DMF已被美国国家环境健康科学研究所（NIEHS）的国家毒理学计划（NTP）选为人类实地研究的四种优先化合物之一。欧盟的DMF的OEL (Occupational Exposure Limit) 为15 mg/m3。
随着行业对DMF危害加深的认识，替代DMF的绿色溶剂的研究成为了热点。
02
替代DMF的绿色溶剂几何？
近年来，许多更环保的溶剂已用于多肽合成。例如，2-MeTHF（2-甲基四氢呋喃，图2）已用于在聚乙二醇骨架的多肽树脂（ChemMatrix）上固相合成 Aib-脑啡肽五肽。偶联条件是在 2-MeTHF 中的 DIC/Oxyma Pure，并且在 2-MeTHF 中用 20% 哌啶除去 Fmoc 基团。
图2. 常见固相多肽合成绿色溶剂
图片来源：使用chemdraw绘制
最近，γ-戊内酯 (γ-valerolactone，图2) 已被用作 DMF 的替代品，用于 ChemMatrix 树脂上 Aib-ACP 十肽的 SPPS。[1] 在这种情况下，DMF 仍用于洗涤和 Fmoc 去除步骤。
研究者表明，最常见的 Fmoc-氨基酸衍生物在 >0.1 M 时可溶于 γ-戊内酯，这使得该溶剂有可能用于自动化合成。
此外，碳酸丙烯酯（propylene carbonate，图2）已作为DMF的替代溶剂用于也向多肽合成（Boc/Bn 策略），以及在 ChemMatrix 树脂上固相合成九肽缓激肽bradykinin（Fmoc/tBu 策略）。 固相偶联时间比在DMF中长 (2 × 1 h)，但在这种情况下，偶联和 Fmoc 去除均在碳酸丙烯酯中进行。[1]
在另外一项研究中最近，N-丁基吡咯烷酮 (NBP，N-butylpyrrolidinone, 图2) 表现出了替代DMF的潜力。 NBP的主要缺点在于它较高的粘度，不利于固相合成中的溶质扩散，加热或许是解决这个瓶颈问题的手段之一。
图3. Smoc化学结构
图片来源：使用chemdraw绘制
同时，水基固相多肽合成 (ASPPS, queous solid-phase peptide synthesis）也成了人们研究的热点
，例如使用磺化形式的Fmoc基团（Smoc, 2,
7-disulfo-9-fluorenylmethoxycarbonyl， 图3）作为Nα的保护基团，从而增加氨基酸在水溶液中的溶解性。EDC-HCl在ASPPS中表现优于其他的缩合试剂。然而，尽管替代溶剂的结果令人鼓舞，发表的文献也非常光鲜，但很多成果在发表之后就陷入沉寂，并没有得到多大的实际应用。而且文献中的大多数示例都是针对非常短的模型肽，使用非常过量的氨基酸与缩合试剂（开发工业多肽合成工艺，通常以1.5当量作为起点），并且经常会采取再缩合的方法以推动反应进行尽可能的完全。
虽然工业界也积极地参与了绿色溶剂的开发，而且是这个行业的主力军，但是真正在临床多肽药物生产的工艺中实现应用的绿色溶剂，仍然是凤毛麟角。
据笔者所知，诺和诺德在他们的一款在研药的生产过程中，使用了DMSO/EtOAc的混合二元溶剂，取得了令人满意的结果，但他们并没有透露更详细的内容。
03
固相多肽合成溶剂开发的难点与痛点
绿色溶剂的开发，之所以出现这种雷声大雨点小的情况，是与任何新鲜事物的上位都类似的必经阶段。
尽管人们逐渐意识到了DMF，NMP等常规SPPS溶剂的危害性，但是工业界所特有的“惯性”（也可以称为惰性），迟滞了绿色溶剂全面登上舞台的时间，这和紧迫性还是息息相关的。工业界目前还没有感受到来自监管机构的压力，或者说压力不足以触发进一步改革的行为。
对于DMF这种黄金溶剂，各大监管机构目前所持的态度还是比较宽松的。DCM则情况不同，监管机构给予了非常严格的标准，在很多国家DCM已经被禁止在工业环境中使用了，除非给出充足的理由，证明目标反应只有在DCM中才能取得可以接受的结果。而DMF目前似乎还没有这样的压力。监管机构的指向，将直接决定绿色溶剂成为主流的时间。
监管机构是外因，真正的内因在于SPPS本身，想要取代DMF这样的黄金溶剂，绝不是一蹴而就的事情。作为固相多肽合成的溶剂，需要至少满足以下各种条件：
⭐ 需要满足各种物质的溶解度，包括保护氨基酸、缩合试剂、缩合试剂添加剂、碱（如果使用uronium或者phosphonium类缩合试剂的话）、活性中间物（例如氨基酸DIC活化酯或者OBt, Oxyma活化酯）、脱除Fmoc的二级胺（例如piperidine），以及副产物（例如diisopropylurea, DIU）等。
⭐ 需要有合适的粘度，因为过高的粘度会显著影响溶质的扩散，从而降低氨基酸活化和缩合的反应动力学。
⭐ 需要对树脂和多肽树脂具有良好的溶胀性，否则多肽缩合很难进行完全。
⭐ 需要有恰当的极性，避免多肽肽链在树脂上产生过度的固相链聚合 (aggregation)，从而严重影响反应动力学。实际上，很多绿色溶剂的最初筛选，是从粘度和极性两个方面入手的。
⭐ 需要保证氨基酸羧基活化、氨基酸缩合，以及Fmoc等保护基去除反应，在理想的动力学下进行，这和溶剂的极性也息息相关。
⭐ 需要将氨基酸活化和缩合中的主要副反应降至最低，例如氨基酸外消旋，DKP, Aspartimide, N端封闭（Nα与缩合试剂的反应）。
⭐ 多肽树脂的稳定性需要得到保障，多肽从树脂上的提前裂解（premature cleavage）需要降低至最低程度。
⭐ 溶剂自身需要具有稳定性，不发生影响反应过程的降解并产生杂质，尤其是潜在的致癌或致变杂质。
可想而知，同时满足以上条件，而且还要具有生态环境相容性，绝对不是可以轻易实现的。这恐怕是潜在的绿色溶剂至今无法全盘取代DMF的重要内因。除此之外，经济因素也是一个不可以回避的问题，绿色溶剂必须拥有稳定的供应链、具有一定的成本优势，至少具有未来可降低成本的空间，最好像2-MeTHF那样可以实现生物来源。
从内外因两个角度来看，绿色溶剂在固相多肽合成的工业领域的应用，需要在监管角度和开发深度方面进行有效推动，但从趋势来看，应该不会是遥远的事情。
参考资料：
[1] Jad, Y. E. et al. F. 2-Methyltetrahydrofuran and cyclopentyl methyl ether for green solid-phase peptide synthesis. Amino Acids. 2016, 48, 419.
[2] Kumar, A. et al. Re-evaluating the stability of COMU in different solvents. J. Pept. Sci. 2017, 23, 763.
[3] Lawrenson, S. B. et al. The greening of peptide synthesis. Green Chem. 2017, 19, 1685,
[4] Lopez, J. et al. N-butylpyrrolidinone as alternative solvent for solid phase peptide synthesis. Org. Process Res. Dev. 2018, 22, 494.
[5] Knauer, S. et al. Sustainable Peptide Synthesis Enabled by a Transient Protecting Group. Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 12984 – 12990.
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