湖北大学系统性改造地衣芽孢杆菌Tat途径，扩展高价值蛋白生产前景

地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis，简称 B. licheniformis）是一种安全、效率的微生物工厂，该菌种能够利用一般分泌（Sec）途径分泌大量的天然细胞外蛋白，因此在工业中广泛用于酶的生产。然而，利用该菌种的 Sec 途径制造异源或天然细胞内蛋白质的效果并不理想。为了解决这些问题，来自湖北大学生命科学学院的研究团队针对地衣芽孢杆菌中的 Tat 途径进行系统性遗传改造，显著增强了该菌种通过 Tat 途径分泌精氨酸酶的能力。结果显示，工程化菌株 0F13 分泌的胞外精氨酸酶活性较亲本菌株提升了 5.2 倍，达到了 577U/mL。除此之外，0F13 还被证实可用于高效生产绿色荧光蛋白等其他无法经 Sec 途径生产的蛋白。研究论文 Engineering the Tat-secretion pathway of Bacillus licheniformis for the secretion of cytoplasmic enzyme arginase 已发表于 Applied Microbiology and Biotechnology 期刊。

（来源：Applied Microbiology and Biotechnology）细菌中的蛋白质跨细胞质膜易位有两种主要运输途径，即一般分泌（Sec）途径和双精氨酸分泌（Tat）途径。两者的主要区别在于，Sec 途径主要分泌的蛋白处于未折叠状态，而 Tat 途径分泌的是折叠甚至寡聚的蛋白，因此该途径所分泌的蛋白种类较少并且通量较低，很难用于工业化生产。然而，Sec 途径无法生产高比例的异源蛋白和细胞质蛋白，因为它们折叠得太快或太紧密。因此，研究人员试图利用 Tat 途径，为此类蛋白质的生产提供一种潜在的解决方案。本次研究中，研究团队先尝试利用地衣芽孢杆菌的 Sec 和 Tat 途径生产精氨酸酶。结果发现，Tat 和 Sec 途径都可以分泌精氨酸酶，但只有通过 Tat 途径分泌的精氨酸酶表现出酶活性。考虑到芽孢杆菌精氨酸酶的活性依赖于锰离子，研究人员认为，通过 Sec 途径输出的精氨酸酶失活可能是由于无法整合锰离子或无法组装成寡聚结构而引起的。以此为前提，研究者针对地衣芽孢杆菌实行逐级修饰的策略以优化 Tat 途径的输出效率，包括筛选和优化信号肽（SP）、并且过表达 Tat 易位酶、信号肽酶（SPase）和细胞内分子伴侣等措施。▲图丨筛选 Tat 信号肽以输送胞外精氨酸酶（来源：Applied Microbiology and Biotechnology）最终，研究者通过过表达 Tat 易位酶 TatAdCd 、信号肽酶 SipS 并且删除 HrcA 的方式创建了菌株 0F13。与原始菌株 0F3 相比，与信号肽 YwbNsp 融合的菌株 0F13 分泌的精氨酸酶活性提升了 5.2 倍，达到了 577U/mL。在此之后，研究人员利用绿色荧光蛋白（GFP）进一步测试了工程化地衣芽孢杆菌对于其他 Sec 不相容蛋白的适应性。结果表明，培养 48 小时后菌株 0F13 的胞外荧光强度较亲本菌株 0F3 增加了 3.8 倍。值得注意的是，来自芽孢杆菌的精氨酸酶是一种含有细胞质辅因子的多聚酶，其能够催化 L-精氨酸水解产生 L-鸟氨酸。而 L-鸟氨酸在人体新陈代谢中发挥着重要作用，能够用于治疗肝病、强心以及增强免疫力，具有广泛的市场前景。因此，精氨酸酶在工业领域备受关注。本次研究中，研究团队利用 Tat 途径建立了一个高效的精氨酸酶生产平台。该研究证明地衣芽孢杆菌具备生产与 Sec 不相容的细胞外蛋白的巨大潜力，其将进一步扩大地衣芽孢杆菌作为高价值蛋白质细胞工厂的能力。根据作者所属机构信息，来自武汉远大弘元股份有限公司的研究者也参与了本次研究。该公司以氨基酸及其衍生物的研发、生产为基础，以武汉大学生命科学学院和湖北省氨基酸工程技术研究中心的成果为依托，长期深耕于氨基酸细分领域，致力于生物医药领域的高新技术产业化。

1.https://doi.org/10.1007/s00253-023-12917-2

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