单细胞多组学绘制原发性中枢神经系统弥漫性大B细胞淋巴瘤的单细胞

单细胞多组学绘制原发性中枢神经系统弥漫性大B细胞淋巴瘤的单细胞景观

2023年，中国科学技术大学第一附属医院神经外科团队在Cell Discovery上发表一篇题为“Single-cell landscape of primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma”的文章，该研究通过单细胞转录组测序(scRNA-seq)、单细胞染色质可及性测序(scATAC-seq)、免疫组库测序(scTCR/BCR-seq)建立了原发性中枢神经系统弥漫性大B细胞淋巴瘤(PCNS DLBCL)单细胞图谱，通过探讨肿瘤内异质性和免疫细胞功能揭示出PCNS DLBCL患者复发和耐药的潜在原因。

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研究背景

原发性中枢神经系统弥漫性大B细胞淋巴瘤(PCNS DLBCL)是一种罕见的侵袭性非霍奇金淋巴瘤。近年来，PCNS DLBCL的治疗取得了重大进展，但是耐药和复发仍然很常见，PCNS DLBCL患者5年生存率仅为30%-40%。与系统性DLBCL相比，PCNS DLBCL具有不同的分子特征和亚型，以及广泛的肿瘤间免疫异质性。然而，在PCNS DLBCL中，瘤内异质性仍不清楚，以单细胞分辨率解决PCNS DLBCL患者恶性细胞和肿瘤浸润免疫细胞的复杂性的研究有限。

文章亮点

01用单细胞技术解决了什么问题？

本研究构建了PCNS DLBCL患者的肿瘤微环境单细胞图谱，并解析肿瘤细胞的不同恶性基因模块，探讨了这些模块如何导致复发和耐药性，对CD8T细胞进行功能状态和拟时轨迹分析，探讨CD8T细胞的耗竭转化过程。单细胞水平上对PCNS和系统性DLBCL进行整合分析，来识别PCNS DLBCL中特异存在的恶性程序。

02实验亮点

将scRNA-seq、scATAC-seq、BCR-seq、TCR-seq技术结合起来，作者对从8名PCNS DLBCL患者的肿瘤组织中分离的CD45+CD19+和CD45+CD19-免疫细胞进行了scRNA-seq。每个样本还进行了scTCR-seq(n=7名患者)和BCR-seq(n=7名患者)，对5名患者还进行了scATAC-seq。

02临床意义

PCNS DLBCL独有的恶性程序中对功能进行鉴定，有助于揭示PCNS DLBCL患者预后不良的潜在原因，此外，预耗竭的CD8T可能是免疫检查点治疗的一个有前景的靶点，这些发现为PCNS DLBCL靶向治疗提供思路。

方法流程

研究结果

1.PCNS DLBCL的单细胞景观

scRNA-seq分析鉴定了四种主要细胞类型，包括B细胞，自然杀伤(NK)和T细胞，骨髓细胞和少突胶质细胞。利用scRNA-seq鉴定的细胞群注释scATAC-seq图谱，使用Seurat优化这两个跨模态数据集。使用已知标记基因的染色质可及性分析区分了scATAC-seq数据的不同细胞簇。

图1 PCNS DLBCL患者的scRNA-seq和scATAC-seq图谱

2.PCNS DLBCL患者恶性B细胞亚群的鉴定

为了区分恶性和非恶性B细胞，进行inferCNV分析。结果发现，B0簇没有显著的CNV，其他15个簇在染色体拷贝数方面存在异质性，显示出PCNS淋巴瘤的典型CNV，例如12号染色体的增加，6号和8号染色体的丢失。结果表明，B0簇细胞是非恶性的，而B1-B15簇细胞是恶性的。

此外，BCR联合分析发现个体患者的恶性B细胞呈现单克隆或很少寡克隆表型。然后，作者基于基因特征对PCNS DLBCL患者的起源细胞(COO)进行分类。结果表明，P73、P201、P202、P203和P205的恶性细胞以ABC-like为主，而P124、P145和P182的恶性细胞以GCB-like为主。

图2  PCNS DLBCL患者恶性B细胞的鉴定

3.PCNS DLBCL患者的恶性基因模块鉴定

为解析恶性B细胞中肿瘤内异质性的转录谱，用 cNMF分析对恶性细胞鉴定了7个基因模块(MPs)。MP1高表达与RNA剪接相关的基因。MP2–MP5主要由与免疫调节/反应相关的基因组成，此外，MP6反映了细胞周期的S和G2/M期，代表PCNS DLBCL中恶性细胞的增殖特征。MP7富集核糖核蛋白复合物生物发生。

为了确定MPs在其他生发中心来源的B细胞淋巴瘤中的潜在作用，作者结合了三个公开的scRNA-seq数据集(包括滤泡性/转化的滤泡性B细胞淋巴瘤；ABC-like B、GCB-like B细胞淋巴瘤)获得了恶性细胞图谱。然后，作者计算了每个样本中MPX细胞的比例。作者发现MP1细胞在PCNS DLBCL中显著富集，表明MP1是PCNS DLBCL特异性模块；MP2细胞在PCNS DLBCL和ABC-like DLBCL患者中显著富集。综上所述，这些MPs反映了PCNS DLBCL的独特特征以及与系统性DLBCL的共同特征。

图3 PCNS DLBCL 患者肿瘤内MPs的鉴定

4.特异性MPs的促肿瘤机制

据报道，在肿瘤进展过程中发生的大规模染色体改变会导致肿瘤内异质性，所以对肿瘤细胞CNV进行分析，以探讨肿瘤内异质性形成的原因。以P201为例，当将P201的CNV分群映射在UMAP时，作者发现节点 I(包含4个CNV分群)与MP1细胞显著重叠，表明MP1细胞是恶性细胞主要的克隆分支，这些结果表明，PCNS DLBCL患者的亚克隆CNV可能是肿瘤进化过程中转录异质性亚群形成的基础。

之后，作者探讨MP1细胞的促癌和耐药机制，因为MP1中的基因富集了与RNA剪接相关的基因组功能，使用剪接或未剪接的reads在节点I细胞与其他节点的细胞之间进行差异表达基因(DEG)分析。当仅计算剪接reads时，节点I细胞具有与RNA剪接相关功能的DEG。当仅计算未剪接的reads时，节点I上调了编码蛋白酪氨酸激酶和Rho GTP酶的基因，这些基因分别激活B细胞受体致癌信号转导和膜信号转导。就未剪接reads而言，节点I的DEG也显示出对B细胞增殖调节的富集，其中抗凋亡基因BCL2被上调。B细胞受体信号和BCL2均可促进DLBCL中的肿瘤存活和耐药性。这些结果表明节点I中的细胞能够富集多种剪接因子(例如SRSF1和SF1)的表达，导致与促存活途径和肿瘤进展相关的功能失调的基因发生剪接。

图4 存在促癌特征的 PCNS DLBCL特异性表型

5.浆母细胞样 MP2 细胞与 PCNS DLBCL 的预后较差相关

MP2高表达MZB1和XBP1，它们是浆母细胞的已知标记基因，表明恶性MP2细胞中存在浆母细胞特征。作者根据外部数据集映射B细胞的注释，发现PCNS DLBCL中的MP2细胞与注释的浆母细胞之间存在很强的对应关系。

接下来，作者鉴定了调节MP2细胞的转录因子(TF)。已知PRDM1，XBP1、IRF4是推动血浆分化所必需的，其中XBP1、IRF4是MP2细胞染色质开放水平上显著富集的TFs。作者对GC簇进行排序，观察到在GC分化后期XBP1和IRF4被激活，而PRDM1在基因表达和染色质开放水平上未被激活，这表明在PCNS DLBCL的肿瘤进展过程中，MP2 B细胞谱系的分化程序可能部分保留。对PCNS DLBCL和系统性DLBCL独立队列的分析表明，具有高MP2特征评分的患者的预后明显更差。说明浆母细胞样 MP2 细胞与 PCNS DLBCL 的预后较差相关。

图5 PCNS DLBCL 中的浆母细胞样表达程序

6.肿瘤反应性CD8 T细胞普遍为耗竭状态

以往研究表明在人类肿瘤中观察到了 CD8 T 细胞不同功能失调状态，所以作者将CD8T细胞单独进行分析，研究其功能状态。鉴定了3种T细胞亚群，为CD8 Tex、CD8 Tprolif和CD8 Tmem-like，然后联合TCR测序分析显示，CD8 Tex和CD8 Tprolif细胞呈现更高的克隆频率。 

作者评估了可选定功能基因在CD8 T细胞中的表达，以评估细胞的肿瘤反应性。发现CD8 Tex和CD8 Tprolif细胞是肿瘤反应性CD8 T细胞(广泛表达耗竭基因和细胞毒性基因)，CD8 Tmem-like细胞是一组旁观者T细胞。比较PCNS DLBCL与脑外 B 淋巴瘤之间 CD8 T 细胞的耗竭程度差异，发现PCNS DLBCL患者的耗竭评分明显高于系统性DLBCL患者。

为了描绘CD8 T细胞的耗竭过程，进行了Monocle3分析。在转录组学和染色质可及性图谱中观察到CD8 T细胞由预耗竭状态(pre.ex)到中间态到耗竭状态(term.ex)的转变。 

然后，作者研究了时间轨迹上基因的表达，发现TCF7和MKI67等基因在伪时间轨迹的开始处表达，表明pre.ex的CD8 T细胞在早期具有自我更新能力。PDCD1和HAVCR2在终点处具有更高的表达水平。染色质可及性水平发现沿着轨迹，pre.ex特异性TF基序逐渐丧失，而term.ex特异性TF基序逐渐增加。该结果揭示了高耗竭状态的CD8T亚群，可能作为PCNS DLBCL预后差的潜在原因。

图6 耗竭的高克隆扩增CD8T细胞和旁观者CD8T细胞的表征

结论

结合单细胞转录组学、染色质可及性测序和免疫组库测序，展示了与肿瘤促进途径、细胞周期和B细胞免疫反应相关的多种恶性程序。通过整合来自系统性DLBC和滤泡性淋巴瘤队列的数据，揭示了一种与 PCNS DLBCL独特相关的RNA剪接活性异常升高的促肿瘤方式。此外，在 PCNS DLBCL 队列中验证发现浆母细胞样程序预示着更差的预后。此外，PCNS DLBCL中克隆扩增的CD8 T细胞经历了从衰竭前样状态到衰竭的转变，并且表现出比系统性DLBCL更高的衰竭特征评分。因此，这项研究揭示了PCNS DLBCL患者预后不良的潜在原因，这将促进靶向治疗的发展。

参考文献

Nianping Liu, Chen Jiang, Xinfeng Yao, et al. Single-cell landscape of primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma.Cell Discov. 2023 Jun 12;9(1):55. doi: 10.1038/s41421-023-00559-7.

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