从数千万计的多肽配体文库中高效地筛选出针对靶标具有亲和力和特异性的多肽既是关键, 也是难点. 传统的组合化学筛选方法周期长、效率低、分析鉴定耗时, 传统的噬菌体展示方法难以进行非天然氨基酸插入或修饰, 具有局限性. 因此, 发展新的筛选方法是高效获得靶向亲和配体的关键途径. 显然, 实现高效筛选的手段其一是采用合理的设计使肽库简并, 其二是发展新型高通量的方法可以快速完成筛选.
赵课组 利用反义肽简并性和正义肽-反义肽靶向识别原理构建了靶向小分子多肽文库. 反义肽现象是根据遗传密码的简并性由核酸向蛋白衍生出来的一种自然现象, 相当于把大量随机的氨基酸排列组合用核酸碱基编码. 例如, 可将一个库容量为20 10 的十肽全库通过理性设计降低8个数量级. 利用反义肽作用的专一性, 筛选到新型的靶向多肽与关键膜蛋白的相互作用, 有效地干扰病毒对细胞的穿透. 作为亲和配基用于蛋白质的分析检测中, 可实现疾病相关诊疗探针的研发. 尤其是该课题组发展的新型溶酶体四次穿膜蛋白的靶向多肽在细胞定位、靶向杀伤、肿瘤诊疗方面具有广泛应用.
此外, 利用计算机建模技术进行多肽文库的简并效果也十分显著. Baker课题组 发明了一款名为“Rosetta”的计算机建模平台, 可将天文数字的全肽库容量(理论库容20 40 )简并为22660并设计了数千种长度约为40个氨基酸的非天然来源的多肽. “Rosetta”建模软件预测这些多肽不仅能与分子靶标紧密结合, 还能抑制靶标蛋白的正常功能, 为药物的快速筛选提供了可能. 在该研究中, 以流感H1血凝素和肉毒杆菌神经毒素B作为筛选靶标, 筛选出了稳定性强、免疫原性低、生物安全性高且抗流感药效优于市售抗体的新型多肽药物(图1(a)).
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上述提及的两种手段各自用巧妙的方法实现了肽库的简并, 使得目标分子最大可能地留在小范围的肽库中. 然而, 很多情况下肽库简并并不能遵循一定的规律, 大规模的筛选不可避免, 开发一类高效而通用的高通量筛选技术非常有必要. 这就需要借助一些自动化的高效的筛选工具. 首先, 新型质谱技术的发展为高效的多肽筛选提供了强有力的工具. Yang课题组基于新型的质谱技术发展了高通量糖基化肽段的筛选方法, 该方法基于阶梯能量的一步质谱采集法, 提高了糖肽鉴定的通量并开发了pGlyco 2.0糖肽检索引擎, 从糖链、肽段、糖肽三个层面对糖肽数据库检索进行精确质控, 从而大幅提升了N糖蛋白质组学分析的通量和精准度. 最后, 这一研究报道了目前最大的糖基化数据集: 在1%的假阳性率下, 研究人员在小鼠的5个脏器中鉴定到了超过一万条N糖肽.
此外, 微流控芯片系统因分析效率高、可灵活设计、自动控制并通量集成等特点在高通量筛选方面显示了独特的优势, 利用微流控芯片技术进行配体文库筛选是研究热点之一. 例如, Xu课题组报道了一种高通量微芯片, 将不同的蛋白点在芯片上形成微阵列, 配体库与芯片进行相互作用, 与阳性蛋白或阴性蛋白结合均会在响应的点阵发出信号, 整个富集过程通过扫描微阵列就可以进行实时监测. 本课题组在微流控芯片高通量多肽筛选新方法上也进行了多年的研发. 基于光刻微腔阵列芯片, 实现10 8 库容量的组合化学肽库分选和基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)原位测序. 全流程可在几小时内完成, 相较于常规方法数天的筛选周期, 效率显著提高(图1(b)). 基于高效率筛选, 进一步发展高内涵筛选, 同时获得更多参数. 将微腔阵列中的多肽以原位“打印”的形式转移至表面等离子体共振成像(SPRi)芯片, 实现实时、在线、免标记检测, 创新地实现了两组阵列同时定性(原位测序)和定量(原位亲和力表征)分析, 检测灵敏度达到纳克级(图1(c)). 利用上述的高效平台, 筛选得到新型多肽靶向多肽CP, 其针对肿瘤干细胞标志物CD133的K D 达到7.37×10 −9 M, 与多克隆抗体相当. CP血液循环半衰期近3 h,与常见多肽的活体半衰期只有数分钟相比, 稳定性显著提高. 将CP与新型近红外二区(NIR-II)信号单元IRT偶联后(CP-IRT)进行活体造影, 肿瘤/健康组织信号比值接近9, 显著优于此前报道的小分子光学探针. 进而, 其还可快速排泄,6小时内约90%的CP-IRT可经泌尿系统排出. 相比之下, 虽然同样具有靶向功能, 抗体修饰的IRT在肝脏大量富集, 显示了小分子探针的优势.返回搜狐，查看更多
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