之前有小伙伴留言说自己进行固相多肽合成的时候不知道如何快速检查反应进展，因为做裂解的话，相对比较耗时。而且今天土狗就将之前整理汇总的一些检测方法分享给大家，如果学会了，评论区吱一声呀！
话不多说，咱们直接上干货！
1. 凯撒测试（茚三酮测试）：多肽合成的“火眼金睛”
凯撒测试就像给伯胺做的一个超灵敏“体检”，在固相肽合成里特别管用，能帮我们稳稳地把控偶联反应的完成度。
凯撒测试的“秘密武器”是茚三酮，它一旦碰上肽 – 树脂的去保护 N-末端氨基，就能变出深蓝色。但得注意，凯撒测试对仲胺检测可不靠谱，要是 N-末端氨基酸是脯氨酸这类仲胺，就得换异吲哚酮测试或氯胺酮测试这些“备用神器”。
凯撒测试的“魔法药水”看似复杂，其实就是把几种试剂按部就班配好。
先配凯撒测试溶液，拿16.5毫克氰化钾溶在25毫升蒸馏水里，倒进49毫升从茚三酮新鲜蒸馏出来的吡啶，取1.0毫升，往小试剂瓶里一装，标上“A”，试剂 A就搞定啦。
接着是试剂B，把1.0克茚三酮在20毫升正丁醇里化开，倒进小试剂瓶，标上“B”。试剂C更简单，40克苯酚在20毫升正丁醇里溶解后，倒进小试剂瓶，标上“C”。
到了凯撒测试程序这步，从试管里取 10-15个beads，往试管 S 和另一个空试管 R（参考）里，各加 2 至 3 滴试剂 A、B、C。把两个试管在 110°C 下加热 5 分钟，一比较颜色，结果就出来了：无色或浅蓝色，说明偶联完全，能继续合成；溶液深蓝但beads无色，偶联差了点，得延长偶联时间或封端未反应的链；溶液浅蓝但beads深蓝，偶联不完全，得重新来过；溶液和beads都深蓝，那就是偶联失败，得检查氨基酸和试剂，重新开始。
2. 未保护脯氨酸的检测：多肽合成的“盲点补漏”
凯撒测试虽好，但对脯氨酸、羟脯氨酸这些仲胺检测时经常“看不清”。遇到 N-末端氨基酸是这类仲胺的情况，就得靠异吲哚酮测试或氯胺酮测试来“补漏”。
异吲哚酮测试的溶液配制，就是把2克异吲哚酮在 60 毫升苯甲醇里搅2小时，过滤后，加 2.5克 Boc-Phe-OH 溶解。程序上，取少量样品，加2至3滴溶液，100°C加热5分钟，beads变蓝就说明偶联不完全。
氯胺酮测试也类似，试剂A是乙醛和DMF混合，试剂B是对氯胺酮溶在DMF里。取1至5毫克树脂，加1滴A和1滴B，静置5分钟，beads变蓝就意味着存在仲胺。
3.自由胺通用检测：多肽合成的“全面体检”
凯撒测试虽是伯胺检测的“金牌方法”，但对仲胺不够灵敏。于是，溴酚蓝测试和 2,4,6-三硝基苯磺酸测试这些“多面手”登场了，它们对碱性胺也敏感，但测试前要把样本beads清洗干净。
溴酚蓝测试就是把 3 毫克溴酚蓝溶在100毫升DMF里。程序是取10-15 个beads，用新鲜DMF冲洗后，加 1-2 滴测试液。beads变蓝至蓝绿色表示偶联未完成；黄绿色表示偶联快完成了；黄色且有绿痕则表示完成了。
2,4,6-三硝基苯磺酸测试的步骤是取出几个树脂珠，用DMF清洗后悬浮在 DMF 中，加1滴试剂A（1%的2,4,6-三硝基苯磺酸）和1滴试剂B（10%的 DIPEA），静置5分钟，用DMF洗涤beads后观察颜色，红色beads表示偶联反应未完成。
4.氨基酸手性纯度：多肽合成的“品质守护”
在固相肽合成中，氨基酸构建模块的手性纯度是成功的关键，每个氨基酸中 1%的不期望立体异构体都会影响最终肽产物的产率和纯度。马弗试剂在这里大显身手，它与氨基酸反应生成对映异构加合物，L-氨基酸生成 L,L-对映异构体，D-氨基酸生成D,L-对映异构体，二者可通过HPLC分离和定量。
确定氨基酸手性纯度的程序：
先去保护 Fmoc-氨基酸，将 10毫克 Fmoc-氨基酸溶解在1毫升丙酮中，加 1 毫升正己烷，搅拌10分钟后移除正己烷。再用1N盐酸调pH至7，加入1毫克马弗试剂溶于丙酮的溶液，40°C 搅拌10分钟。取0.1毫升反应液稀释至1 毫升，在HPLC（C-18 柱）上运行，对照组不含氨基酸，通过 HPLC 图谱就能判断手性纯度啦。
5.Ellman 测试：多肽合成的“巯基探测器”
Ellman 测试专门用于定量检测肽样品中的游离巯基，对监测二硫键形成和检测含游离巯基肽的质量很有帮助。
Ellman测试步：将 5,5’-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB，Ellman试剂，40毫克）溶于0.1M磷酸钠缓冲液，稀释肽样品至3毫升含0.1-0.2微摩尔肽的溶液。加0.1毫升DTNB，室温静置15分钟。用 1 厘米比色皿在410 纳米处测吸光度，用 DTNB 加磷酸钠缓冲液作参考溶液测吸光度，最后代入公式就能算出巯基浓度啦。
掌握这些检测方法，就像给多肽合成装上了“千里眼”和“顺风耳”，能让我们在合成过程中随时掌控反应进程，及时发现问题并调整策略，从而大大提高多肽合成的成功率和效率。这些方法看似繁琐，但每一步都有其独特的意义和作用，是我们迈向高质量多肽合成目标的坚实阶梯。
参考文献：
1. Vágner, J.; Šafár, P.; Lebl, M. Collect. Czech. Chem. Commun., 1988, 53, 2541-2548.
2. Wellings, D. A.; Atherton, E. “Methods in Enzymology Volume 289: Solid-Phase Peptide Synthesis” Ed. Fields, G. B. Academic Press, San Diego, 1997, p. 54.
3. Vojkovsky, T. Pept. Res., 1995, 8, 236-237.
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