摘要：目的:探讨生物活性肽AN-M的固相合成工艺,并为工业化合成目的肽提供理论依据。方法采用固相法,以Fmoc-保护基保护的α-氨基酸和Wang树脂为原料,经1—氧—3—双二甲胺羧基苯骈三氮唑四氟化硼盐(TBTU)、1—羟基苯并三氮唑(HoBt)、二异丙基乙胺(DIEA)缩合,20%哌啶的DMF溶液脱保护,用切割试剂将AN-M粗品从Wang树脂上切割下来。结果经反相高效液相色谱分析纯化,可得目的肽的得率大于67．00%,最终成品的纯度在98．78%以上,经质谱鉴定其分子量与理论值一致。结论该合成方法步骤简便、便于操作、产品得率高,可用于大规模合成目的肽。
关键词： Fmoc固相合成法 多肽 AN-M
在生物机体中多肽类物质是重要的组成成分之一,在体内各器官中有许多复杂而特殊的生理活性,例如生物机体中一些器官所分泌的激素类物质,研究和挖掘多肽(尤其是人工合成的小分子多肽)与体内各种脏器的特殊生理作用,可以提供许多预防和治疗人类疾病的有效方法 [1,2] 。随着人们对多肽类物质作用的研究,多肽的人工合成也日益引起人们广泛的关注。1963年,美国著名生物化学家Bruce Merrifield发明了多肽固相合成法 [3] ,自此以后,多肽固相合成法被广泛应用于多肽和蛋白质的研究领域,特别是短肽的合成。固相法合成多肽是多肽合成领域的一个重大的突破,对化学、生化、医药、免疫分子微生物学等领域都起到了巨大的推动作用 [4] 。
AN-M是由17个氨基酸组成的多肽,可用于神经系统疾病的治疗,并且可提高细胞内ATP水平,因此,该多肽在医疗行业有广阔的应用前景,但是其工业合成方法不太理想,不便于大规模合成。Fmoc方法是一种多肽固相合成的新方法,该方法使用的氨基的保护基是Fmoc,Fmoc对酸稳定,易与碱作用,可以应用碱性化合物作脱保护剂 [5] ,与本实验合成方法一致。因此本文采用Fmoc作为氨基酸保护基,将目的肽的第一个氨基酸Fmoc-Pro-OH的羧基以共价键的形式与固体载体Wang树脂相连,以形成的产物Fmoc-Pro-Wang Resin为多肽合成的起点,在载体树脂上使要合成的多肽进行逐个延伸缩合接肽反应,最终合成17肽AN-M的序列。将其酸解脱离树脂可得到粗品,然后再对所得到的粗品进行鉴定和纯化得到最终产品。该合成工艺成本低、便于控制、可以用于工业化大规模合成目的肽。
1 实验部分
1.1 试验方法
1.1.1 树脂的活化
取Wang树脂10.0克(1mmol/g)加入反应器中,用DMF150ml浸泡30min,使树脂充分膨胀,以活化待用。
1.1.2 Fmoc-Pro-OH与Wang树脂的连接
在活化后的树脂中加入要连接的第一个氨基酸(Fmoc-Pro-OH),再加入DIEA、DMAP、DMF作为缩合剂,使之反应1h。将反应液过滤除去,用异丙醇洗涤反应树脂2次,用DMF洗涤树脂3次。每次洗涤不少于1min。
1.1.3 氨基保护基的脱除
在接肽反应之前需要对和氨基相连的Fmoc保护基进行脱保护,使用脱保护试剂是20%六氢吡啶的DMF溶液,脱保护采用二次进行的方法,一次脱保护5min,第二次脱保护20min。
1.1.4 固相上的接肽反应
实验中多肽的合成方向是由羧基端→氨基端,成肽反应使用缩合剂为TBTU、HoBt、DIEA的混合液,反应时间约为1.5h。先将已连接上的第一个氨基酸Fmoc-Pro-OH脱保护,然后加入下一个氨基酸进行缩合,如此重复脱保护→缩合的过程至所有氨基酸连接完毕。
1.1.5 氨基酸连接效率检测
在每一步缩合反应后取少量的反应树脂加入到5%茚三酮的无水乙醇溶液(W/V)中,在沸水中水浴3min,观测树脂是否变色。
1.1.6 AN-M-树脂的切割
经上述方法合成的17肽AN-M最终需要从树脂上切割下来。切割试剂为:TFA、苯甲硫醚、巯基乙醇、水和苯酚,其用量依次为100ml、5ml、2.5ml、5ml和7.5g,将配置好的试剂放入冰箱中冷冻备用。将用N2吹干的AN-M-树脂加入到冷冻状态下的切割试剂中,室温下磁力搅拌3h左右,然后经砂芯漏斗过滤到冰乙醚中,离心,收集沉淀。用纯水溶解所得沉淀,得到的溶液用真空冷冻干燥机冻干,即得多肽粗品。
1.2 AN-M的鉴定
合成的多肽粗品经过质谱进行鉴定,以确定结果中是否含有所要合成的目的产物。本文采用MALDI-MS质谱法来鉴定所得产品,通过质谱图上的分子量和理论值的比较来确定合成的结果。
1.3 AN-M的纯化
因为肽合成过程中的各种副反应、消旋化等原因使所合成的多肽不纯,再者在脱保护的过程中由于保护基的残留、肽键的断裂、烷基化等也造成产品不纯[6]。根据目的肽的要求可采用适当的方法进行纯化。本文选用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)进行纯化。
2 结果与讨论
2.1 树脂的活化
因为树脂在使用前为干态保存,所以需要用有机溶剂对其进行浸泡使之成为湿态,内部溶胀成网状,即对其进行活化,以利于待反应基团进出树脂之间的空隙。活化方法为DMF活化30min。
2.2 多肽链的延伸缩合剂
用TBTU、HoBt、DIEA作为肽键合成的缩合剂,它们有缩合效率高、反应速度快、不易发生消旋化反应,且不受氨基酸种类限制的优点 [7-8] 。
2.3 自由氨基的检测
在合成过程中需要检测氨基酸的缩合程度,保证多肽有较高的合成效率,在每一个氨基酸进行缩合反应后进行检测,若检验结果为无色说明没有自由氨基酸存在,缩合反应完全。若检验结果为蓝色或紫色或黑色,说明仍有自由氨基酸存在,缩合不完全,且颜色越深说明存在的自由氨基酸越多。这时需要继续加缩合剂进行缩合直至检验结果为无色。
2.4 HPLC分析
反相高效液相色谱是分离效果最佳的方法之一,在多肽合成的分析和分离纯化中显示出优越的能力 [9] 。本次试验中选用C18反相柱进行分析。所得目的肽的色谱图1:
图1 粗肽的液相色谱图
色谱分析条件:C18,反相,4.6×250mm,梯度洗脱,梯度从90%A+10%B到10%A+90%B时间是60min,流速为1ml/min,紫外检测波长为215nm,流动相A为0.1%三氟乙酸的超纯水溶液,流动相B为0.1%三氟乙酸的乙腈溶液。经质谱鉴定,确定目标峰为面积最大峰,然后对其进行纯化分离,产物的纯度分析色谱图2:
图2 纯化多肽的液相色谱图
经过反相高效液相纯化后最终可以得到纯度在98.78%以上的产品。
2.5 质谱鉴定分析
合成的多肽用质谱法进行鉴定,它可以给出合成多肽的精确分子量,本文采用MALDI-MS对其进行质谱分析。分析条件:将合成多肽的冻干品配制成浓度为0.5mg/ml的30%乙腈水溶液,直接进行分析。所得质谱图3:
图3 多肽AN-M的质谱鉴定图
由上图可以得到合成多肽的分子量为1620.62,与AN-M的理论分子量1620.87一致,证明合成多肽即为目的产物。
3 结论
第一个Fmoc-AA-OH的缩合剂是DIEA、DMAP和DCM,后面的氨基酸的缩合剂用TBTU、HoBt、DIEA的混合液,可有效地提高缩合效率。在肽链合成后,切割试剂可有效地切除和多肽相连的树脂和侧链保护基团。
试验中使用的Fmoc固相法合成多肽的方法,反应条件比较温和,副反应比较少,可用于大量合成多肽 [10] 。合成的多肽AN-M经质谱分析分子量为1620.62与理论分子量1620.87相一致。由分析图1可得目的肽在粗肽中的含量大于67.00%。经过反相高效液相色谱分析纯化后,由分析图3可得目的肽的最终纯度可达98.78%。应此可以说明本次试验合成的多肽AN-M与理论计算的结果相一致。
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