肽核酸（peptide nucleeic acid, PNA）是将DNA/RNA的糖磷酸二酯骨架用含肽键的新型骨架取而代之而得到的，一般结构如下图所示：
注：B代表不同的碱基
在它的结构中，侧链碱基距骨架间隔3个键，分子中相邻两个侧链之间的间隔为6个键，其距离参数与DNA、RNA中相应参数基本相同，保证了PNA与DNA等结合时的牢固性。同时由于其结构特殊，避免核酸酶的降解，提高体内的稳定性。
1.肽核酸的合成
1）从PNA结构来看，PNA合成思路是将PNA拆成侧链块和骨架块两个基本建筑块，即氮上带有取代基（2-乙酸基）的核酸碱基和末端伯胺基带保护基的N-（2-氨乙基）甘氨酸
2）2个建筑块分别合成完成后，用肽键进行连接，得到单体。
将得到的单体再进行类似多肽合成的链延长，得到PNA。侧链块碱基上有伯胺基团保护，相对比较容易合成，除胸腺嘧啶不需要保护外，其他3种碱基均涉及到这个问题。
注：取代基（2-乙酸基）的核酸碱基 末端伯胺基带保护基的N-（2-氨乙基）甘氨酸 单体
1.1侧链块的合成
一般合成方法有：胞嘧啶乙酸、腺嘌呤乙酸、鸟嘌呤乙酸
★★ 胞嘧啶乙酸的合成中涉及环外4位伯胺基的保护，一般采用Cbz 或取代的苯甲酰基保护，保护之后的胞嘧啶再和溴乙酸甲酯等反应得到1位氮被烷基化的产物，接下来在一般的酸性或碱性条 件下，完成酯的水解这里介绍两种方法。
★★ 腺嘌呤乙酸的合成涉及环外6位伯胺基的保护，除文中介绍的两种保护基外，也有采用4-甲 氧基苯二苯甲基氯(Mmt-Cl) 来保护的。
★★ 鸟嘌呤乙酸的合成，鸟嘌呤上伯胺基的保护是几个碱基保护中最困难的，涉及N⁹ 的保护(一般用酰基来保护),同时避免 N⁷ 受到不必要的影响，目前其合成方法 也在不断改进。
1.2 肽核酸主链骨架的合成
PNA 合成的重点是主链骨架的合成，按反应原料和合成路线，大致可分成3大类，分别是：以乙二胺为原料、氨基酸为原料、以Ugi反应为基础进行的合成。
★★ 以乙二胺为原料：有两条路线，第一条是以经过乙二胺单保护，再合成PNA单体；第二条是由乙二胺先合成PNA单体主链,再保护。
第一条路线有2种方法，其中第I种方法尝试了以固相合成为基础，使用激活剂 PyBroP以提高胺与碱基乙酸反应的产率，其保护基选用氢化还原脱除的对甲氧苄氧羰酰氯(Moz-Cl), 此法成本较低，碱基变换容易。
第二条路线有3种方法，第1种主要生成短小PNA, 这类PNA有利于对细胞膜的通透性。第2种反应条件比用Boc保护和Fmoc保护方法更为温和，目前该方法已被用于多聚物的固相合成。第3种反应的特点主要是由Fmoc基团提供了一个亲脂“把手”，从而是PNA通过HPLC纯化时更为有效。
★★ 以氨基酸为原料：一种方法是利用不同的氨基酸经过二次还原再与甘氨酸反应，完成单体的合成。其中R是可变的，并由它在 PNA分子中引入了手性中心，有研究证明，适当的手性中心可增加PNA与 DNA 或 RNA结合的稳定性，且对裂解酶更稳定， 纯化只集中在最后一步。Puschl,L.Kosynkina 等人曾对类似的方法进行过研究。
另一种方法的合成策略与前法类似，只是将甘氨酸换成其他氨基酸，从而改变了侧链取代基，得到单体(10),它具有提高PNA 的水溶性、序列特异性等性质。在合成中采用将组合固相合成与光催化技术结合的方法可快速产生大量不同的PNA71。
★★ 以 Ugi反应为基础进行的合成：Ugi反应作为基于异腈的多组分缩合反应中的典型代表，具有条件温和，副产物少，反应步骤少等优点。利用该反应进行的PNA合成一改传统多肽合成的模式，大大简化了反应历程。原型Ugi反应以胺、羧酸、异腈、醛(或酮)为原料，四组分经一步缩合生成α-氨酰基酰胺类化合物。
Ugi反应进行合成的策略有2种，第1种方法具有Ugi反应的有点，取代基多变，适用于PNA结构，如PNA的生物学标记等。该方法的四组分中较关键的是被保护的氨基乙基异腈，它上面的两个功能基：胺基和异腈基（13）作为延长链的纽带，其合成的难易直接影响整个路线的完成。它的缩合产物（14）脱保护后作为胺组分来参与下一轮 Ugi 反应。另外，四组分之一的酸(12)换成硫代酸、磷酸均适用，使寻找新 的性质独特的PNA 效率大大提高。Ⅱ法在连接方式上稍有不同，它将Ugi 反应与多肽合成方 法相结合，较前面几种多肽合成方法简捷。经过四组分缩合产生的是类似氨基酸的PNA单体。
2. PNA类似物的合成
目前的PNA类似物有多种多样，包括骨架原子顺序的改变、基团的替换、侧链的变化等等，现就几种变化较大或合成方法特殊的类似物合成方法加以叙述。
2.1a-PNA的合成
a-PNA的主链由 L-a- 氨基酸构成，主链上每 单元骨架多一个羰基。与PNA的不同主要在于PAN碱基距主链的一段中不含羰基。α-PNA的合成以苏氨酸（16）作为起始物，该反应在固相或液相中均可进行。液相合成中带有碱基的氨基酸(17)可被偶联到甘氨酸乙酯上，得到α- PNA 单体二肽(18)。
2.2 手性PNA的合成
手性PNA的每一单元只含一个肽键，是一种在合成上和结构变化上都较灵活的类似物。它具有手性，且比PNA更易变换形状，使其在与DNA等结合时更具灵活性。其单体(19)在合成上采用标准的多肽固相合成方法，其中重要一步是Vit B12参与下的光催化自由基加成。
2.4 转位PNA类似物的合成
转位PNA(retro-inverso PNA)虽与PNA相比只将酰胺键进行了翻转，但性质却比PNA改进了许多。它比PNA有更好的识别DNA序列的能力，其构型的变化还减少了与水溶性介质的相互作用。
2.5 0-PNA的合成
可能因其醚键的灵活性，O-PNA的水溶性好于 PNA, 对互补的DNA 呈现全或无的杂交形式，其手性也使其结构变化更为丰富，其合成从L-同 型丝氨酸入手。
2. 肽核酸的应用
核酸肽是一类DNA结构类似物，是有效的反义/抗基因靶向性制剂，不被核酸酶、蛋白酶及肽酶等降解，与DNA、RNA形成的杂交体非常稳定，在抗病原体、抗肿瘤和分子杂交、PCR反应、基因分离等分子生物学领域显示出强大的应用潜力。
一些体外研究已显示，PNA-dsDNA 链复合体是非常有效的转录延伸抑制剂，并能完全阻碍与蛋白质(如转录因子)的结合，抑制转录的开始，但是，由于哺乳动物细胞PNA的摄入量太低，这方面的进展一度受限。然而，最近在这方面的研究和开发有了新进展。已经发现，一些小肽分子，当与PNA 连接时，能增加细胞对PNA 的摄入量或作载体将PNA引入细胞的特定部位。这些小肽分子可以提高培养基中的PNA被导入真核细胞的速率。
3.1 PNA的反义和抗基因作用
3.1.1 PNA作为反义抗病原体制剂
PNA由于其与DNA和RNA结合的能力具有明显的反义和抗基作用，因而可以用于基因治疗和靶向性药物的开发及功能基因组学研究。研究者研究了PNA对HIV-1 gag 基因的体外逆转录抑制作用，并检测了与HIV-1 gag 基因的不同区段作用的PNA对 HIV-1,MMLV 和 AMV 3种逆转录酶的逆转录作用效应，发现它们都被PNA/RNA 复合体在预计位点阻断。研究者对大肠杆菌β-半乳糖苷酶和β-内酰胺酶起始密码区互补的PNA反义抑制作用进行研究，结果发现统统性较高的大肠杆菌菌株（AS19）中PNA的抑制作用比在野生型K-12中更强。同时，在翻译和细菌生长的研究中显示，与23S rRNA的功能性位点结合的PNA可在大肠杆菌无细胞转录/翻译系统中抑制翻译。这种体外抑制效应与已知的翻译抑制剂和四环素等类似，具有剂量效应。此外，PNA还能抑制琼脂平板和液体培养基中细菌的生长，而使用具有类似碱基组成但无关或序列错配的PNA时则无抑制作用。研究发现与HIV-1基因的引物结合位点互补的PNA和PNA-DNA异源嵌合体能完全阻断tRNA₃ -Lys的结合，从而阻断HIV-1逆转录酶的体外逆转录的起始。还发现，RNA/PNA 或RNA/(PNA-DNA)杂交体对HIV-1逆转录酶RNase H 活性具有完全的抵抗性；PNA侵入DNA/RNA杂交体后完全组锻炼RNA链的切割。这提示在逆转录过程中所需要的HIV-1 RNase H 活性也被PNA寡聚体所抑制。这些研究表明，PNA寡聚体可能通过干扰HIV-1复制过程的多个步骤而具有很强的治疗性潜力。
上述研究提示，一旦有了新加细胞摄入量的方法，PNA可以用作”遗传性抗生素“，而在开发”传统抗生素“的过程中PNA也可以用作有效的靶向性制剂。
3.1.2 PNA用作反义抗肿瘤制剂
在急性早幼粒细胞白血病患者中，有＞95%的病例与抗早幼粒细胞白血病PML/RARa融合蛋白有关。研究者发现，使用抗PML/RARa翻译起始区或多聚-嘌呤区的PNA，在体外特异性抑制了该融合基因的转录和翻译。此外还发现，包括AUG翻译起始密码子在内的PML/RARa癌基因3个不同区域作为靶位点的反义PNA在无细胞系统中对翻译有抑制作用。当3种PNA联合使用时，几乎全完（≥90%）特异地抑制了PML/RARa 基因的翻译，显示基因中不同PNA的反义效应的累加作用。总所周知，原癌基因的异常激活是细胞恶变的常见特征。因此，选定相应的PNA对一些癌基因的表达进行抑制是一种合理的治疗癌症策略。与此类似，应用PNA可以有效阻断e-myc基因等原癌基因的表达。PNA还能抑制人黑素细胞中端粒酶的活性。
3.2 PNA在杂交技术中的应用
3.2.1 陈列和核酸生物感受器研究
PNA在杂交中具有高度稳定性、高的辨别错配能力，可用于陈列和核酸生物感受器的研究。2种新的基于固相杂交的技术充分展现了PNA区别于DNA的独特的化学特性。其一是将DNA靶序列于PNA陈列杂交后检测杂交产物中DNA核苷酸中的磷，因为PNA不含磷。
3.2.2 突变筛查和基因组多态位点的检出
PNA与DNA双链中的互补链的杂交产物可通过毛细管电泳分离，因为PNA-DNA杂交体与原始DNA具有不同的带电性和摩擦率。PNA/DNA的杂交体的Tm值比相应DNA/DNA 杂交体高出10℃，因此在一定高温度和强离子浓度下，DNA与DNA不能杂交，而PNA/DNA 的杂交体也将解链，除非PNA与DNA之间的序列是完全配对的。当改变杂交反应中PNA的浓度时，通过杂交产物的毛细管电泳可以检出是否存在突变及突变的性质。由于PNA:DNA 双链的杂交特性具有碱基含量和序列的高度依赖性，将PNA与特定“质谱标志”(mass-tag)结合后，再与固相支持物上的DNA靶序列杂交，洗去不严格配对的PNA 后，可用于MALDI-TOF(matrix-as-sisted laser desorption /ionization time-of-flight) 质谱分析，以获得每个等位基因的特征性峰。通过质谱位置和信号强度，还可有把握地对碱基置换进行检测并半定量。这在进行多众位点多态性分析时是一种简便、快速而准确的常方法。
3.2.3 原位杂交
PNA特别适用于原位杂交技术。PNA首先是用于端粒的染色，继后，证明在几种原位杂交程序中是成功的，尤其是“端粒研究”已受益于 PNA 的原位杂交。在这一应用中PNA 的优越性最有可能应归因于其骨架的电荷为中性，后者可降低背景 PNA 的背景结合，从而加速这些条件下的杂交反应。
3.3 PNA在PCR反应中的应用
PNA嵌合是一种调整PCR反应的方法，设计与正常等位基因碱基序列一致的PNA，使之与野生等位基因结合，抑制其扩增，从而是突变的等位基因得到大量的扩增。这种封闭作用可以选择性扩增/抑制只有一个碱基差异的靶序列。这项技术可以用于研究肿瘤中低水平的癌基因突变，在反应中抑制野生型基因的扩增，或抑制一个等位基因。也可被用于遗传性变异的临床诊断研究以及微生物变异研究。如当寻找大量正常细胞中所含的微量瘤细胞时，癌基因可在30万陪量正常基因的背景下被检测。这将在癌症诊断中具有重要意义。同样，对于遗传性群体筛查也将具有重要作用。毫无疑问，PNA也可被构建成检测信标，用于如PCR反应的适时监测等。
3.4 PNA在核酸捕获和基因分离中的应用
3.4.1 核酸捕获
应用PNA捕获可进行核酸样本制备。PNA 可用作单链核酸的序列特异性捕获。而双链DNA 的一般性捕获(如用于PCR 分析的DNA 样本制备),可采用作为一种普通捕获探针的T₇-bis-PNA来实现。此外，已经设计了一种高度序列特异性捕获dsDNA的方法，该法借助生物素化寡核苷酸，运用两种被捕获位点旁侧的bis-PNA DNA opener而完成，它要求被捕获的DNA片段中有两个相距小于10 bp的同质型嘌呤序列，且每个的长度不少于7 bp。
3.4.2 基因分离
根据PNA 与 DNA/RNA 的序列特异性结合特点，将生物素标记的PNA 与含待分离DNA 片段的DNA 样本杂交，然后用磁性亲和素微球可将特定基因片段分离。如Boffa等[40]将生物素标记的、CTG 重复序列PNA作为探针结合染色质中的CAG 重复序列，再与磁性亲和素微球蛋白结合，从染色质中分离特定基因片段。他们高效地从转录活性染色质中分离了TATA- 结合蛋白的转录基因。这一作用可望利用生物素标记 PNA 探针对直接 在正常和病变细胞中进行分离特定基因；还可利用PNA 的杂交特性用亲和层析分离核酸。该法高效，特异性强，还可用于能形成二级结构的大核酸分子的分离。
3.5 PNA的其他应用
PNA与双链DNA能进行序列特异性结合的能力可用于其它一些方面，如用作限制酶切割的抑制剂、同质性嘌呤片段的电子显微镜标记、基因激活剂(即作为一种人工转录因子)、以及与单链特异性核酸酶协同，作为“合成的限制酶”。不过，上述作用都需要在低盐条件下，避免盐离子对链置换反应的抑制效应才有可能达到。此外研究者发现，转录缓冲液中盐离子对PNA 链置换反应的抑制可通过T7和 T3噬菌体RNA聚合酶的转录活性而克服，因为此时(PNA)2/DNA复合体的形成大大加速。
【相关文献】
1. 肖翠英,张思仲,张志勇.肽核酸及其应用[J].国外医学(分子生物学分册),2000,(第5期).
2. 张婷,徐萍.肽核酸及其类似物的合成方法概述[J].中国药物化学杂志,2002,(第3期).
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