摘要：本文综述了多肽的液相分段合成方法，这些合成方法是近年来多肽和蛋白质合成领域中的一种发展趋势。详细介绍了天然化学连接、化学区域选择连接、施陶丁格连接等方法，并对这些方法进行了比较，指出其优点及不足并提出改进办法。最后对多肽合成技术的发展做了进一步展望。

关键词：多肽、液相、分段、合成

多肽类药物是“十五”期间国家的重点攻关项目。多肽类药物制剂与蛋白质药物制剂相比，有其独特的优点：1)分子量小，无免疫原性，比较安全；2)结构相对简单，功能较明确，副作用小；3)分子比较小，易于合成，生产成本低，也易于多途径给药和吸收；4)合成的多肽纯度较高。基于上述优势，多肽类药物以总销售额年增长率为19%的速度增长，与增长率为9%的总体医药市场相比，多肽药物可谓是令人注目的亮点。而且自人类基因组测序工作完成以来，在人类后基因组的研究过程中，需要合成大量的多肽和蛋白质。这使得对多肽合成的研究具有重要的意义。

R.B.Merrifield成功创建的经典固相多肽合成方法(SPPS)标志着多肽合成进入了一个全新的时代。主要设计思想是：将带有氨基保护基的氨基酸的羧基键合到一个不溶性的树脂上，脱去该氨基酸的氨基保护基，同下一个氨基酸的活化羧基连接来延长肽链，从而得到多肽。但随着肽链的延长，特别是数十个氨基酸残基以上的多肽合成，其保护基可能会脱落，树脂与肽间的共价键也会部分断裂,其原因有待于进一步探究。针对这一问题，目前有3种可用于制备长肽的技术路线：生物提取法、基因工程法和分段合成法。生物提取法即从动物组织中直接提取多种肽类混合物的方法。因生产工艺路线不完善，所得产品中常含有动物蛋白。在临床应用期间，有些病人会产生过敏反应，疗效欠佳。为获得质量高、疗效好的多肽类制剂，科学家开始探索应用基因工程方法制备多肽，虽制备所得的多肽与天然品具有相同的生物活性，但基因工程方法有高效表达的技术难题，并且所需成本过于昂贵，难以形成规模生产。而近年来发展起来的多肽液相分段合成方法是多肽及蛋白质合成领域中的又一重大突破，即多肽片段在溶液中，依据其化学专一性或化学选择性，自发连接成长肽的合成方法。因多肽片段含相对较少的氨基酸残基，从而纯度较高，且易于纯化。下文将介绍多肽的液相分段合成方法及其进展。

1 天然化学连接及其延伸方法

1.1 天然化学连接(Native Chemical Ligation)

天然化学连接方法是近年来多肽和蛋白质合成技术中最有效途径之一，也是目前最简单和实用的多肽片段连接方法。1994年，Kent等人将C端为硫酯的多肽段与N端为Cys(半胱氨酸)残基的多肽段加到pH值为7.6的磷酸盐缓冲液中进行反应，从而得到以Cys为连接位点的多肽。反应步骤如下：首先C端(1)的硫酯与N端(2)Cys残基的侧链巯基发生酯交换反应，生成新的硫酯中间体(3),此中间体自发形成过渡态五元环，继而又迅速进行S-N端酰基迁移，最后形成了以Cys为连接位点的多肽产物(4)。如图1所示：

图1 天然化学连接反应步骤图

利用天然化学连接技术，Shin等人合成了具有抗菌活性的糖蛋白；Tam等人制备了含多个Cys残基的环状蛋白；Duhee等人通过两段缩合和三段缩合的途径成功合成了一种分子结构稳定的含46个氨基酸残基的蛋白质Crambin;Regula等人利用该方法合成了含69个氨基酸残基的前神经多肽(poNPY)。Cabor等人也利用该方法合成了第一个半人造的丝氨酸蛋白酶SGT。

利用天然化学连接技术合成的多肽中必须含有Cys残基作为连接位点。调查研究表明，仅1.7%的蛋白质含Cys残基，而且Cys残基在蛋白质序列中的位置也不一定是很好的缩合位点。因此，天然化学连接技术的推广受到了阻碍。研究人员又开始了对天然化学连接技术延伸的探索。

1.2 化学区域选择连接(Chemo and regioselectiveligation)

在研究中发现，2-巯苄基(2-mercaptobenzyl)可作为辅助基与硫酯发生反应。如在其苯环上引入甲氧基，可增加芳环上的电子浓度和辅助基的亲核性，从而提高了限速步骤硫酯交换反应的速率及辅助基对酸的敏感度。这无疑加快了片段间的缩合速度，也有利于辅助基的最终脱除。由此延伸山的“化学区域选抒连接方法”,是拟Cys位点的连接技术。该方法是利用C端(1)的硫酯与N端(2)辅助基中的巯基发生酯交换反应，生成新的硫酯中间体(3),该中间体经过六元环过渡态，自发进行分子内S-N端的酰基迁移，得到多肽(4)。如图2所示。

图2 化学区域选择连接反应步骤图

利用化学区域连接技术，Liang等人以Ala(丙氨酸)-Gly(甘氨酸)为位连接位点，成功合成了环状抗生素小菌素J25;John等人以Lys(赖氨酸)-Gly为位连接位点，合成了含62个氨基酸残基的Scr同源域-3(SH3);Francesco等人也利用该方法合成了新甘油共轭体和对寡聚糖的模拟。

用化学区域选择连接方法缩合的片段是无侧链保护的多肽片段。合成该片段时，须用强酸如HF来除去侧链保护基和脱除树脂。但产物肽段对酸很不稳定，易受到强酸的影响，因此给N端肽段的合成造成一定困难。

1.3 可去除辅助基(removable auxiliary)连接方法

在改进辅助基的研究中发现，苯胺衍生物N-(1-苯基-2-巯乙基)辅助基团不仅具有片段间缩合速率快的优点，而且对强酸保持稳定，使得N端多肽片段较易合成。由此衍生出可去除辅助基连接方法。其反应步骤为：C端(1)的硫酯与N端多肽片段(2)先进行硫酯交换反应，生成新的硫酯中间体，经过渡态五元环，进行分子内S-N端的酰基迁移。得到目标多肽(3)。如图3所示。

图3 可除去辅助基连接反应步骤图

利用可除去辅助基连接方法，Paolo等人以His(组氨酸)为连接位点，合成TATA结合蛋白(TBPA),缩合率达到87%;以Gly-Lys为缩合位点合成巨噬细胞趋化蛋白-1(Mcp-1),缩合率达到76%;以Gly-Ala作为位点合成Mouse Larc,缩合率达到到92%;Raffaele等人在该方法的研究过程中还发现：在一定条件下，Cu＋和Cu²＋可促进缩合反应的进程。

1.4 光敏感辅助基(photoliabile auxiliary)连接方法

为探索更柔和的除去辅助基的条件，研究中发现O-硝基苄基(O-nitrobenzyl)见光不稳定，如将其引入到巯乙基基团上，得到新的辅助基：N-2-巯基1-(2-硝基苯)乙基，简写为Mnpe辅助基。该辅助基具有很强的亲核性，除继承了缩合率高的优点外，而且见光易分解，使得脱除辅助基的条件大大简化。C端(1)的硫酯与N端(2)辅助基上的巯基先发生硫酯交换反应，生成新的硫酯中间体(3)经五元环过渡态，再进行分子内S-N端的酰基迁移，得到含辅助基团的多肽产物(4)。最后用365 mm的紫外线照射含有磷化氢的缓冲液，几小时后可脱除辅助基，得到目标多肽(5)。如图4所示。

图4 光敏感辅助基连接反应步骤图

利用紫外光脱除辅助基得到的多肽纯度较高，有时无需纯化。Torus等人利用该方法以Gly-Gly为连接位点合成了含20个氨基酸残基的多肽，证实了Mnpe辅助基可成功作为辅助基合成多肽，而且大大提高了产物的纯度。但因辅助基见光易分解，故反应条件较苛刻。

2 施陶丁格连接及其改进

Staudinger等人依据生化反应——叠氮反应，发展了施陶丁格连接方法，该方法与天然化学连接方法都是多肽片段缩合的基础方法。其反应机理如下：C端(1)的膦硫酯与N端(2)的叠氮化合物首先生成含有亲核性氮的中间体——亚氨正膦(3),其亲核性氮可在分子内抢夺到供应体供给的酰基，发生分子内重排，生成酰胺膦盐(4)。酰胺膦盐再水解得\到多肽(5)和膦氧化物(6)。如图5所示。

2.1 施陶丁格连接(Staudinger ligation)

图5 施陶丁格连接反应步骤图

Maarseveen等人利用该方法合成了含7～9个氨基酸残基的环状N-乳酰苯胺。Bardley等人也验证了该方法是一种有效的片段缩合方法，它拓宽了片段缩合领域。但同时发现膦硫酯作为辅助基对一些氨基酸缩合率很低，如以Gly为缩合位点,缩合率不超过35%。因此施陶丁格连接方法的应用受到阻碍。

2.2 正交化学连接(orthogonal chemicalligation)

在改进施陶丁格连接方法的过程中发现，将过渡态的圆环变小，可使具有亲核性的酰亚氨中的氮更接近于具有亲电子性的硫酯中的碳，可用于提高产物的产率。利用该方法同样在Gly位点缩合，缩合率可达92%。其改进方法如下：用简单的亚甲基取代辅助基中的苯基，即将辅助基I简化为辅助基Ⅱ(见图6),来降低膦的亲核性，最小化膦对氧气的敏感度，从而降低了发生副反应——氧化反应的可能性。正交化学连接反应机理为：C端(1)的膦硫酯与N端(2)的叠氮化合物首先生成中间体——亚氨正膦(3),中间体发生分子内重排，生成酰胺膦盐(4)。酰胺膦盐再水解得到多肽(5)和膦氧化物(6)。如图6所示。

图6 正交化学连接反应步骤图

由于在反应过程中a碳的化学立体结构没有被破坏，因而利用该反应生成的二肽产物有很高的收率，可高达到90%以上。利用该合成路线已合成出含124个氨基酸残基的核糖核酸酶A(R Nase A)。

3 结论

多肽分段合成技术是多办实事肽合成的有效途径之一，在多肽合成领域中发挥着举足轻重的作用。天然化学连接是多肽分段合成的基础方法，也是目前应用最广的多肽合成方法。该方法的局限是所合成的多肽必须含Cys残基，因而限定了天然化学连接方法的应用范围。化学区域选择连接、可除去辅助基连接、光敏感辅助基连接都是天然化学连接方法的延伸，是仿Cys位点连接的缩合方法，扩展了天然化学连接方法的应用。同时它们具有各自的优势和不足。

施陶丁格连接方法是另一种基础的片段连接方法。它的成功缩合拓宽了多肽片段连接途径的思路。正交化学连接方法是施陶丁格连接方法的发展，通过简化膦硫酯辅助基来提高片段间的缩合率。

总体说来，多肽合成技术还不够完善，多肽合成领域还存在着一定的问题。比如，温度可以改变多肽的构象，如何调整温度达到最佳缩合效果；如何在合成过程中最小化外消旋作用；寻找更好的溶剂和缩合剂来提高缩合率。这一系列问题还有待于进一步研究和探索。

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