摘要：多肽固相化学合成法是蛋白质研究领域非常重要的研究方法之一, 可分为Merrifield和Fmoc方法, 在生物药物、蛋白质工程、免疫学等研究中得到了广泛的应用。介绍了多肽的固相合成法, 包括多肽合成原理、固相多肽合成的分类、合成步骤。

关键词： 多肽 固相合成 方法 分类 步骤

1 概述

自Merrifield创立并发展固相合成多肽方法, 使得多肽合成领域取得了重大突破, 对生化、医药、免疫及分子微生物学等领域起到了巨大的推动作用。随着对连接分子、脱除方法和保护基的不断研究, 近年来固相方法在多肽合成上的应用发展迅速。利用这一方法几乎能够高收率地制备任何多肽。

1963年, Merrifield提出固相合成多肽的思想, 现在固相多肽合成技术已经成为多肽合成中的一种常规技术, 除了Merrifield当年建立的Boc固相法外, 1978年Meienlofer和Atherton等人采用Carpino报道的Fmoc基团作为氨基保护基, 成功的进行了多肽合成。Fmoc固相法已得到广泛的应用并愈加受到人们的重视。多肽固相合成法在药物研究领域、蛋白质结构研究领域、免疫学研究领域呈现着不可比拟的优越性。多肽固相合成法在生物制药及蛋白质工程中有着广阔的应用前景。

目前, 大量合成多肽, 可以采用多肽合成仪, 通过改进多肽合成仪的功能, 可使合成过程完全自动化, 从而提高合成效率, 节约试剂, 降低成本。

2 多肽固相合成

2.1 原理

首先对组成目的肽的氨基酸进行改造, 使其成为氨基末端带有保护基的氨基酸。将目的肽第一个氨基酸的羧基以共价键的形式与固相载体相连, 再以这一氨基酸的氨基为合成起点, 使其与相邻氨基酸的羧基发生酰化反应, 形成肽键。然后让包含有这两个氨基酸的树脂肽的氨基与下一个氨基酸的羧基反应, 不断重复这一过程, 直至目的肽形成为止。接着目的肽从树脂上裂解, 进行氧化折叠, 这样得到了人上合成肽的粗产品。再进行纯化, 化学修饰, 进行活性鉴定。重复上述步骤, 即缩合-洗涤-去保护-洗涤-缩合, 直至得到目的肽链。

2.2 分类

固相多肽合成在近几十年的发展中逐渐分化为2种类型。 (1) Merrifield固相合成, 也称为Boc固相合成。 (2) Atherton和Shepard所发展的Fmoc固相合成法。由于脱Fmoc保护基以及将产物从树脂上切下时反应条件温和, 而且与Boc固相合成相比Fmoc固相合成的副反应少, 所以Fmoc固相合成法已经被广泛采用。

Fmoc固相合成法是常用的多肽合成方法, 其反应条件温和, 单步反应产率高达98%以上。

2.3 固相多肽合成的基本步骤

以Fmoc策略固相合成多肽为例。

2.3.1 树脂的活化

取一定量的树脂置于固相反应器中, 加入5.0m L无水DMF浸泡溶胀2小时, 减压抽去溶剂DMF。

2.3.2 氨基酸的耦联

活化的Fmoc-AA-OH:4.0eq.Fmoc保护氨基酸、3.6eq.HOBt和8.0eq.DIPEA溶于4.0m LDMF中。

第一氨基酸耦联到树脂上的方法为4eq.Fmoc保护氨基酸3.6eq.HBTU和0.1eq.DMAP溶于4.0m LDMF中, 加入8eq.DIPEA, 室温摇荡反应10小时, 减压抽去溶剂, 以DMF (4.0m L×5) 洗涤树脂。加入乙酸酐:吡啶:DMF=2:1:3的溶液6.0m L, 摇荡30分钟, 封闭树脂上未反应的官能团。依次用DMF (4.0m L×3) , DCM (4.0m L×3) 和DMF (4.0m L×3) 洗涤树脂, 20%派啶/DMF脱保护 (4.0m L×3) , 时间为10分钟和20分钟。然后开始进行接肽反应, 每一轮都按表中程序进行。除了Fmoc-Ser/Thr (Ac3-β-O-G1c NAc) -OH是采用两倍用量, 其他氨基酸活化的方法为4eq.Fmoc保护氨基酸、3.6eq.mmo1HBTU、4eq.HOBt和8eq.DIPEA溶于4.0m LDMF中, 将反应液加入固相反应器中室温摇荡2小时。耦合完毕后, 用Kaisers试剂进行检测, 若反应呈现阳性说明耦合不完全, 重复耦合步骤。

2.3.3 多肽的切除和沉淀

树脂用DCM洗涤几遍后, 真空抽干。往装有树脂的多肽固相反应器中缓慢加入:三氟乙酸/三异丙基硅烷/水 (TFA/TIS/H2O) =95/2.5/2.5 (v/v) 溶液5.0m L, 反应3小时。过滤, 氮气吹去大部分的溶剂后, 向残液中倒入20.0m L无水乙醚, 出现白色絮状沉淀, 在4000RPM转速, 5℃条件下离心5分钟, 倒去溶剂乙醚, 向沉淀中加入无水乙醚20.0m L, 振荡, 同样条件下离心5分钟, 再重复一次, 除去大部分的杂质。沉淀真空干燥24小时。固体残留物用离子水溶解, 冷冻干燥得到白色絮状固体, -20℃保存。

2.3.4 多肽的分离纯化

将冻干的粗品多肽, 溶于20%乙腈/水溶液进行高效液相色谱 (HPLC) 分离。HPLC在Waters-600E多通道系统上进行, 选用DE-VELOSIL ODS-UG-5 C18半制备柱。 (10.0×250mm) 和Waters-2487紫外检测器 (λ=215和254nm) , 或Varian (Pro Star 215) CC 125/4nucleodur C18 gravity制备柱。用含有0.6%TFA的乙腈和水溶液进行梯度洗脱。收集主要峰产物, 进行电喷雾质谱或MAL-DI-TOF质谱鉴定。减压旋蒸除去HPLC的样品锋中的乙腈。在冷冻干燥机上冷冻干燥, 获得目标产物多肽, 多肽样品-20℃保存。

2.4 检测方法

最终产物经过ESI-MS方法鉴定, ESI-MS采用软电离方式, 电离后的分子化学键一般不会被破坏, 因此可以直接得到较强的分子离子锋数据, 试验得到目标化合物有分子离子峰、加钠的分子离子峰和加钾的分子离子峰。

质谱条件:样品溶解于甲醇, 通过Cole-Parmer 74900注射泵打入电喷雾质谱。电喷雾质谱条件:喷雾器压力为7.0或11.0Psi, 干燥器 (N2) 流速为4.0或8.0L/分钟, 温度为300℃。喷雾针电压为4.0k V。

3 结论

多肽合成的成功与采用的活化、偶联等方法有关, 但更多的是取决于选择性保护脱保护策略。在“最小保护”策略下, 醇和酚性羟基、巯基、甚至羧基, 都可以不加保护, 但只限于使用中度活泼的酰化剂, 例如活泼酯。假如大量地试用酰化剂, 或者当使用更活泼的中间体时, “最小保护”策略就不适用。在固相载体上增长肽链, 如果使用酸酐或DCC-HOBt方法, 就需要更大的保护, 在极端情况下就是“最大保护”。在中等保护或最大保护策略中, 脱保护时的选择性至关重要。最终除去合成的肽链上的一切保护基是极为关键的操作, 应当引起极大的注意, 以便保证组合起来的肽链不受伤害。新型Fmoc固相多肽合成方法的优越性正在逐渐为人们所认识。即以Fmoc作为α-氨基的瞬间保护基, 与作为C端羧基和一系列侧链功能基的半永久性保护基 (如Boc基) 配套形成正交保护。每步偶联之后, 用弱碱溶液脱Fmoc保护, 肽键形成之后用三氟乙酸脱侧链保护。由于结晶性的活泼酯和Fmoc-氨基酸的对称酸酐可以得到, 所以该研究方法切实可行, 并很快得到广泛应用。

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