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MC4R的纳米抗体激动剂
文献分享
文献分享｜Nature Communications: 黑皮质素受体-4(MC4R)特异性正构纳米抗体激动剂的结构解析
“Structure elucidation of a human melanocortin-4 receptor specific orthosteric nanobody agonist”一文报道了一种针对黑皮质素4受体 (MC4R) 的特异性正构纳米抗体激动剂的发现及结构解析。本文通过构建骆驼纳米抗体库以筛选并鉴定出特异性激动剂纳米抗体 pN162。研究了 pN162 诱导的 MC4R 信号传导途径，包括对 Gs 和 β-arrestin 的招募以及 Gq 信号传导的影响，并与其他配体进行比较。确定了 pN162 结合的 MC4R-Gs 复合物的的冷冻电镜结构，揭示了 pN162 与 MC4R 的独特相互作用模式，为理解 MC4R 的功能和开发新的治疗策略提供了重要基础。
Q
什么是黑皮质素-4受体 (MC4R) ？
黑皮质素-4受体 (MC4R) 是黑皮质素受体家族成员之一，其家族成员还包括：MC1R、MC2R、MC3R 和 MC5R。该家族也是 GPCR 超家族中具有重大治疗前景的一个亚家族，属于视紫红质样A类GPCR。
MC4R 主要在中枢神经系统中表达，是调节能量消耗、饱腹感以及体重的关键临床调节因子。MC4R 功能丧失性突变的人体表现出肥胖等相关症状。
Q
为什么要研发 MC4R 的纳米抗体激动剂？
现有 MC4R 激动剂的局限性：目前市场上的 MC4R 激动剂（如Setmelanotide）缺乏受体选择性，存在脱靶效应，并且可能引发不良副作用。
纳米抗体激活剂的优势：pN162 与 MC4R 的特异性结合位点使其能够精准地作用于 MC4R，避免与其他黑素皮质素受体亚型相互作用，从而减少脱靶效应，提高药物的安全性和有效性。
研究方法·研究结果
1
MC4R 活性状态的构建与纳米抗体库的筛选
ConfoBody 稳定活性状态 GPCR 构象：通过使用ConfoBody（Cb80）基因融合到MC4R-β2AR杂合GPCR的C末端来稳定 MC4R 的活跃状态。
纳米抗体库的构建：利用这个活性状态的 MC4R，通过遗传免疫的方式在美洲驼（Llama）体内诱导产生纳米抗体库。
纳米抗体库的筛选：利用噬菌体展示技术，筛选出与 MC4R 特异性结合的纳米抗体。
2
MC4R 特异性激动性纳米抗体的鉴定
图1 MC4R 特异性激动性纳米抗体的选择和鉴定的工作流程图
通过均相时间分辨荧光（HTRF）实验确定了与MC4R 特异性结合的纳米抗体：命中率为33.8%。对所选 MC4R 结合物的序列分析区分出73个不同的纳米抗体序列簇。
使用ConfoSensor分析进一步筛选出能够招募Cb80的纳米抗体：发现73个簇变体中有19个（26.0%）能够招募Cb80，初步表明这些纳米抗体能够诱导 MC4R的构象变化。
在cAMP信号传导分析中，筛选出的16种纳米抗体均能通过产生第二信使 cAMP 来诱导信号，证实了它们的激动剂活性。
3
激动性纳米抗体的信号传导能力评估
图2 对已筛出的16种纳米抗体做实时环磷酸腺苷（cAMP）监测
通过实时cAMP监测评估，pN162 被鉴定为最有效的完全激动剂纳米抗体，其 EC50 与内源性配体相似。
4
激动性纳米抗体 pN162 的特异性分析
一
pN162 与 MC4R 特异性结合
通过流式细胞术评估纳米抗体与黑素皮质素受体亚型的结合情况，发现 pN162 仅特异性地与 MC4R 结合，不与其他亚型结合（图3a、b、c）。
图3 激动纳米抗体 pN162 对黑皮质素受体的体外信号效力（a：流式细胞术测量的 MC4R 的细胞表面表达情况；b：流式细胞术测量的 c-Myc 标记的 pN162 与 MC4R 的细胞表面结合情况；c：流式细胞术测量的c-Myc标记的 pN162 与黑素皮质素受体亚型的细胞表面结合情况；d：pN162 对SHU9119 放射性配体的剂量依赖性置换的实验结果呈现）
二
pN162 与 MC4R 的正构口袋或重叠表位相互作用
通过放射性配体置换检测，发现pN162能够完全置换拮抗剂SHU9119，表明其与 MC4R 的正构口袋或重叠表位相互作用（图3d）。
三
pN162 是一种特异性的MC4R激动剂
通过对不同受体亚型激活的比较，进一步确认 pN162 是一种特异性的MC4R激动剂。（图4）
图4 pN162 和对照配体(内源性激动剂 α-MSH 以及临床标准肽激动剂 Setmelanotide)诱导的 MC4R9(a)、MC1R(b)、MC3R(c)、MC5R(d) cAMP 信号传导
5
激动性纳米抗体 pN162 的信号传导途径分析
图5 a&b：Gs ConfoSensor 检测(a)、β-arrestin 招募检测(b)中 pN162、α-MSH 和 Setmelanotide 在有（实线）或无（虚线）1 mM Ca²⁺情况下的结果
通过检测 Gs 和 β-arrestin 的招募情况，发现pN162 与 α-MSH 和 Setmelanotide 一样通过这两个途径发出信号，但 pN162 诱导的招募似乎与 Ca²⁺ 离子无关，这与 α-MSH 和 Setmelanotide 诱导的招募相反（图5a、b）。
6
激动性纳米抗体 pN162 与 MC4R 复合物的结构解析
图6 pN162 结合的 MC4R 与 Gs 的冷冻电镜结构
确定了 pN162 结合的 MC4R 与 Gs 的冷冻电镜结构，分辨率为3.4Å（图6）。直观地了解 pN162 与 MC4R 结合时整个复合物的结构形态，以及与 Gs 的相互作用情况，为后续分析结构特征和功能机制提供基础。
7
激动性纳米抗体 pN162 与 MC4R 的相互作用细节
细节一
发现 pN162 结合后 MC4R 呈现出与其他激动剂结合类似的激活特征，但在Gs相互作用区域的构象变化以及参与相互作用的残基不同。结构分析显示pN162 的 CDR3 占据了与内源性配体α-MSH和合成类似物setmelanotide相同的正构口袋位点（图7）。
图7 pN162、α-MSH 和 Setmelanotide 活性状态 MC4R 在 Gαs 相互作用前庭中的结构比较
细节二
发现 pN162 与 MC4R 的独特相互作用模式，包括 CDR3 在正构结合口袋内的取向以及关键的相互作用残基（R101、R104和P105）。pN162 不依赖于钙离子作为辅因子，钙离子被R101替代并形成盐桥相互作用（图8）。
图8 激动剂和拮抗剂配体与 MC4R 的结合模式
研究结论
1
发现了一种高效的 MC4R 特异性纳米抗体激动剂：pN162 具有高活性和特异性，是一种有潜力的抗肥胖治疗药物。
2
解析了 pN162 与 MC4R 的结构和作用机制：为进一步设计和优化 MC4R 激动剂提供了理论依据。
3
为开发新型抗肥胖药物提供了新的思路和方法：纳米抗体作为一种新型的治疗性抗体，具有广阔的应用前景。
临床应用潜力
工具分子：此类 MC4R 特异性分子可作为工具，用于解构 MC4R 信号通路，为临床治疗提供信息。
肥胖治疗：鉴于 MC4R 在体重调节中的重要性，该研究为肥胖治疗提供了新的潜在药物靶点。
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参考文献
Fontaine, T., Busch, A., Laeremans, T. et al. Structure elucidation of a human melanocortin-4 receptor specific orthosteric nanobody agonist. Nat Commun 15, 7029 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-50827-7
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