一、杂交瘤的抗体技术背景
在单克隆抗体的制备过程中，杂交瘤技术发挥着关键作用。这种技术涉及将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞与具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。在HAT选择培养基中，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交瘤细胞才能存活和增殖，从而产生特异性的单克隆抗体。
传统的杂交瘤技术中，聚乙二醇（PEG）方法是一种常见的细胞融合手段。然而，PEG方法存在一些缺点，比如它会引起骨髓瘤细胞与不仅包括所需的B淋巴细胞，还包括其他不需要的B淋巴细胞和脾细胞的随机融合。此外，PEG方法还会导致骨髓瘤细胞、B淋巴细胞和脾细胞之间的不受控制的融合。由于这种非特异性融合，筛选和克隆目标杂交瘤细胞需要大量的时间和精力，进一步降低了获取所需杂交瘤细胞的效率。
为了克服这些限制，研究人员开发了几种改进的方法来提高单克隆抗体（mAb）的产生效率。这些方法包括对杂交瘤技术的改进以及全新的技术，如抗体噬菌体展示技术和单B细胞抗体技术。尽管存在这些挑战，杂交瘤技术仍然是一个非常有价值的工具，用于生产单克隆抗体，这些抗体在诊断、成像和治疗方面具有很高的临床意义。一旦杂交瘤细胞稳定，这些细胞系就能提供无限的同质抗体生产，这种方法也是成本效益高的。
二、低免疫原性抗原的抗体筛选更加困难
针对相对小分子量抗原开发新型单克隆抗体，尤其是那些与小鼠蛋白高度同源的抗原，往往是一项艰巨的任务。在传统的杂交瘤技术中，使用全抗原免疫产生的抗体通常富含免疫显性的B细胞表位，这使得获取能够结合较低抗原性表位的抗体变得不太可能。此外，通过含有表位序列的线性肽免疫获得的抗体可能无法结合构象表位。
单B细胞技术提供了一种从单个B细胞中直接获取mAb的方法，相比传统的杂交瘤技术，它具有更高的效率，能够快速且简单地从免疫个体中获得特定mAbs。这项技术的优势在于能够保持自然的认知VH和VL配对，并且不需要培养B细胞，也不需要使用实验动物。然而，单B细胞技术的局限性在于需要昂贵的单细胞分选设备，以及可能需要高技术专知来处理RT-PCR程序。
三、新技术研究B细胞靶向（BCT）技术
B细胞靶向（BCT）技术提供了一种创新的解决方案。这项技术的核心在于通过B细胞受体（BCR）精准识别并选择由特定抗原激活的B淋巴细胞，基于抗原与抗体之间的高度特异性和强效结合，促进高特异性和高亲和力单克隆抗体的生成。
B细胞受体（BCR）是位于B细胞表面，负责特异性识别及结合抗原的分子，其结构是由两条相同的轻链和两条相同的重链组成的四聚体。BCR的胞质区很短，不能直接传递抗原刺激信号，因此需要Igα（CD79a）和Igβ（CD79b）的协助来完成信号转导功能。
本文概述了一项利用优化的B细胞靶向（BCT）技术成功生成针对人肌红蛋白（hMyo）特异表位的高亲和力单克隆抗体的研究。hMyo是一种低分子量抗原，与小鼠肌红蛋白有高同源性，传统方法下难以产生针对其特异位点的抗体。BCT技术通过预选致敏B淋巴细胞，克服了这一难题，特别是在处理与小鼠蛋白高度同源的抗原时。研究中，优化的生物素化hMyo（bio-hMyo）的制备，通过调整NHS-生物素的摩尔过量比例，显著提高了抗原性，从而增强了B细胞与骨髓瘤细胞的复合物形成，提高了融合效率和ELISA阳性率。
参考：先进的杂交瘤技术通过B细胞受体选择性生产高亲和力单克隆抗体
简单评价：目前的研究结果仅限于人源肌红蛋白（myoglobin），为了将优化的B细胞靶向（BCT）技术普适化，需要进一步确定其他抗原的生物素化位点和最佳生物素化率。生物素化位点的精确控制非常重要，NHS-生物素对蛋白质的生物素化应考虑与赖氨酸残基（Lys residues）局部环境相关的多个因素，包括溶剂可及性、静电能量、氢键数量以及估计的pKa值。
四、蛋白奇点关注非天然氨基酸用于抗体筛选
1. 体外抗体筛选
为了克服这些限制，研究人员采用了一些新的方法，包括将光反应非典型氨基酸（ncAA）整合到目标抗原的表位中，以便筛选噬菌体展示库。
陈龙欣博士以第一作者身份在Science子刊《Science Advances》上发表了题为“Epitope-directed antibody selection by site-specific photocrosslinking”的长篇研究论文。该研究提供了一种高效的针对精准靶向表位的单克隆抗体药物筛选新技术，有望拓宽或迭代抗体药物研发管线。
2. 体内表位定向抗体诱导
特定非天然氨基酸修饰目标表位后，体内对该表位的免疫应答产生强大的富集功能，大幅提升困难抗体筛选的成功率。
首次实现体内针对抗原目标空间表位的定向抗体应答。通过在抗原中定点插入化学交联活性的非天然氨基酸，利用体内B细胞克隆选择、进化，产生表位特异性的抗体应答，这种作用效果显著，产生的抗体大多数识别目标表位。
该方法普遍适用于各种蛋白和多肽抗原。表位靶向富集可用于高效筛选药物抗体，为领域内的困难靶点的功能性抗体筛选提供独特的技术；并且可以提高抗原免疫后的中和抗体效价，有望成为开发高效重组蛋白疫苗的新技术。
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