大家好，今天为大家推荐一篇发表在JACS上的文章，文章标题为“Disulfide-Directed Multicyclic Peptide Libraries for the Discovery of Peptide Ligands and Drugs”，通讯作者是厦门大学化学化工学院吴川六教授, 主要从事生命分析化学、分子影像探针等相关领域的课题研究。主要研究内容包括：1）发展高亲合力和高特异性的化学分子探针和高灵敏的荧光分析方法；2）发展具有限制构型的多元环肽分子模板，构建多功能的多肽分子成像探针工具；3）发展多肽分子内二硫键精准配对技术，构建多元环肽库，针对重要蛋白质分子，筛选活性多肽分子。
具有稳定三维结构的多环肽具有结合小分子和蛋白质的潜力，是药物设计和发现的突破口，然而，多环肽的开发在很大程度上仅限于天然产物。在不依赖现有天然支架的情况下，开发具有新的结构和功能的多环肽仍然是一个很大的挑战。在这里，作者报告了一种基于新型二硫导向基序的设计，开发具有强大蛋白质结合能力的多种多环肽的通用而可靠的方法，这些多肽被称为二硫定向多环肽(DDMPs)，本研究为在天然支架无法获得的序列和结构空间上制备新一代多环肽开辟了新途径，极大地有利于多肽药物的发现。
含有双半胱氨酸的肽基序，如CPPC和CXC (C:半胱氨酸;P:脯氨酸;X:任何氨基酸)倾向于形成二聚体与一对交织二硫键，这形成了DDMPs定向折叠的基础。人血浆纤维连接蛋白是一种二聚体，由一个短肽基序反平行连接，其中两个半胱氨酸残基之间有一个3- mer肽段PIE(即CPIEC)，表示CPIEC基序的二硫导向效应。为了检验当两个CPIEC基序被引入一个肽段时CPIEC基序的二聚二硫配对倾向是否被保留，合成了两个CPIEC基序由一个5- mer和一个13-mer肽段分隔的肽段，这两种多肽的主要产物都是通过反平行互序二硫对约束的环(84和75%)。没有观察到基序内二硫化物配对产物的形成，这意味着CPIEC基序中存在的弯曲应变不利于基序内二硫化物的形成。因此，这些结果证明了CPIEC基序通过促进反平行互序二硫键配对来指导多肽的二硫键配对和折叠的能力。通过残基突变研究表明，第一个P对二硫导向效应具有关键作用，CPIEC基序具有高度可变性。这些结果表明CPXXC是一种有效的、可变的二硫导向基序，具有指导多肽氧化折叠的能力。
随后，作者利用CPIEC(和CPXXC)基序来指导具有两个额外半胱氨酸残基的多肽的氧化折叠，因为这是设计具有定向折叠性和序列耐受性的多环(双硫基)多肽的基础。作者研究表明CPXXC基序引导具有三个二硫键的多肽折叠的能力，可以通过操纵CPXXC基序和半胱氨酸残基的模式(或排列)来设计不同DDMPs。这使得DDMPs有希望成为重新设计多环肽库的支架。这些多环多肽的二硫配对主要由CPIEC基序指导。因此，利用具有CPXXC基序的DDMPs作为模板开发多环肽库，以选择能够结合多种治疗目的蛋白的肽配体。
鉴于CPXXC基序强大的二硫导向能力及其高度可变性，可以利用噬菌体显示系统设计具有极高序列随机化程度的DDMP文库。为了测试该文库的一般适用性，作者选择了四种不同的细胞表面蛋白作为靶点，即ephrin – a型受体2 (EphA2)、成纤维细胞生长因子受体1 (FGFR1)、人表皮生长因子受体2 (HER2)和人表皮生长因子受体3 (HER3)。这些蛋白质的肽结合剂可作为靶标试剂用于开发肽药物偶联物等治疗方法。经过三轮生物筛检后，观察到这四种蛋白均大量富集。应用Sanger测序和下一代测序对富集噬菌体进行鉴定，结果显示出较高的多样性，这可能是由于库中随机序列空间的覆盖率极低。纯化后，对这些DDMPs与靶标的结合亲和力进行评估，其值从100 nM到低微摩尔水平，证实了该文库在发现多环肽配体方面的普遍适用性。
由于从初级库中选择的一些肽配体仅表现出低微摩尔亲和力，尝试开发一种直接的亲和成熟方法。以HER2结合剂L- 5为例，将前体序列分为两个片段，分别用NNK密码子随机化，设计并制备了一个收敛的二级文库(图5)。将该文库应用于HER2，经过四轮生物筛选后，获得了噬菌体的广泛富集，对前50个富集序列的分析揭示了一个一致序列，该序列M-2与富集程度最高的序列(M-1)，利用SPR技术评估其对HER2的亲和力(图5)，分别以60和108 nM的解离常数(KD)与HER2结合，表明与前体L-5 (KD: 1.1 μM)相比，亲和力增加了10倍以上。同时与线性肽相比，DDMPs具有更强的蛋白水解抗性。
总而言之，作者报道了一种新的二硫导向基序的发现和鉴定，该基序可用于指导多环肽的二硫配对和折叠，这使得新的二硫导向多环肽(DDMP)库的开发成为可能，得益于二硫导向基序的序列可变性，DDMP文库中发现了具有多种不同结构的多环肽，这些多环肽能够结合不同的蛋白质靶标。这项研究不仅为配体和药物发现提供了一类新的DDMP库，而且启发研究者们探索新的二硫导向基序和它们之间的合理组合，以设计多环肽(库)。
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