（一）二硫键的定义
二硫键（Disulfide Bond）广泛存在于激素（hormones）、酶（enzymes）、生长因子（growth factors）、毒素（toxins）、免疫球蛋白（immunoglo-bulins）等多肽与蛋白质中，是由两个半胱氨酸（Cys）残基的巯基（-SH）通过氧化反应形成的共价键（-S-S-），也称为二硫桥（见图1）。这种键不仅能够稳定蛋白质的三级和四级结构，还能增强其生物活性、酶稳定性以及热稳定性，是维持蛋白质空间结构和功能的重要因素。
根据二硫键形成位置可分为：分子内和分子间两种类型。分子内二硫键存在于同一肽链中，主要负责稳定蛋白质的三级结构；而分子间二硫键则存在于不同肽链之间，有助于稳定蛋白质的四级结构。
图1： 由半胱氨酸氧化酶（蛋白二硫异构酶PDI）提供氧化还原环境
（二）多肽二硫键的化学合成策略
多肽二硫键的合成方法多种多样，具体选择取决于目标多肽的结构复杂性、所需二硫键数量以及实验条件等因素，主要包括以下几种：
空气氧化法：这是最经典的方法，通过将巯基还原态的多肽溶于水中，在近中性或弱碱性条件下（pH 6.5-10）进行氧化反应，通常需要24小时以上。为了降低分子间二硫键形成的概率，通常在低浓度条件下进行。
DMSO氧化法：使用DMSO作为氧化剂，利用DMSO的亲核性，能够与巯基（-SH）发生反应，形成二硫键（-S-S-）。这种反应通常在水溶液中进行，且DMSO与水的混溶液使其能够在广泛的PH范围内（3-8）发挥作用，尤其适合碱性或疏水性肽的二硫键形成。这种方法的优势在于可以在温和条件下形成二硫键，同时避免了强氧化剂可能带来的副反应和对敏感氨基酸的损伤。
H2O2氧化法：使用过氧化氢作为氧化剂，是一种温和的氧化方法，但其分解过程可能需要额外的控制和处理，以避免副产物的产生和潜在的安全风险，即需要更复杂的后续处理。
酶催化氧化反应：利用特定酶（如胱硫醚-β-合酶或胱硫醚-γ-裂解酶）在特定位置引入或去除二硫键，实现精确控制蛋白质。
化学方法：通过硫化氢处理、碘氧化和硒化等化学反应在氨基酸上形成二硫键（见图2），能够显著提升多肽的结构稳定性和生物活性，但是化学反应也可能会带来副作用（敏感氨基酸的损伤、副产物的生成、修饰效率的限制）。
例如：通过碘氧化反应将多肽中的巯基（-SH）转化为二硫键（-S-S-）。这种方法适用于多种溶剂体系（甲醇水溶液或醋酸水溶液），通常将多肽溶解于25%的甲醇水溶液或30%的醋酸水溶液中，然后逐滴滴加10-15 mol/L的碘溶液进行氧化，反应时间一般为15-40分钟。但在碘氧化法过程中需要注意控制条件，如含敏感氨基酸残基（Tyr、Trp、Met、His），这些敏感氨基酸残基可能因为点的存在而发生不可逆的化学修饰或降解，从而影响最终产物的质量或者纯度。为了确保反应的精确性和产物的稳定性，在碘氧化完成后，通常需要立即加入维生素C或硫代硫酸钠以除去过量的碘，防止副反应的发生。
图2：蛋白质中二硫键的形成过程，分为两种类型：分子内二硫键和分子间二硫键。
点击化学：使用环己烯酮和炔等点击试剂在氨基酸上形成二硫键，这种方法反应条件温和且可控，这一方法基于点击化学反应的特点，能够精确控制二硫键的位置和数量，同时对多肽的结构和功能影响较小以及适用范围广泛。
固相合成法：在固相合成过程中，通过选择不同的巯基保护基（如Trt、Acm、Mmt等），分布氧化形成二硫键。这种方法不仅适用于复杂的多对二硫键成环技术，还能提高合成效率和产物质量。
逐步保护基策略：通过逐步去除保护基来形成二硫键，这种方法可以精确控制二硫键的位置和数量。在合成多肽中，选择合适的保护基对半胱氨酸残基进行保护，可以避免在后续反应中发生非目标的氧化或副反应。保护基具有酸性不稳定、酶不稳定或还原不稳定性的特点，可以在特定条件下被逐步去除，从而释放自由巯基，通过氧化剂促进两个自由巯基之间的S-S键形成，从而实现精确控制二硫键的形成位置。
（二）多肽二硫键在医药领域的应用方向
药物递送系统：含二硫键的多肽因其结构稳定性，被广泛用于药物递送系统中。例如，通过在多肽或聚合物分子中引入二硫键，可以形成交联结构，提高药物的稳定性，并实现药物的控制释放。这种机制通常利用谷胱甘肽（GSH）在细胞内还原环境中的二硫键，从而释放药物。
靶向治疗：含二硫键的多肽因其高亲和力和特异性，常被用于靶向治疗，如肿瘤新生血管的抑制。例如，含有两个二硫键的环状RGD肽对肿瘤新生血管内皮细胞的抑制能力显著高于线性肽，这使其成为肿瘤治疗的有力候选物。
抗癌药物开发：含二硫键的多肽作为前药策略，在癌症治疗中具有重要应用。通过设计二硫键连接的药物-药物偶联物，可以在肿瘤微环境中实现药物的精准释放，从而提高治疗效果并减少副作用。
生物活性分子的稳定化：含二硫键的多肽因其结构稳定性和热稳定性，被广泛用于生物活性分子的开发。例如，套索肽是一种含有多个二硫键的天然多肽，具有高热稳定性、抗蛋白酶降解能力，因此在药物载体中具有重要应用潜力。
基因治疗：二硫键在核酸药物递送中的作用也逐渐显现，例如通过二硫键连接的自交联多肽载体，可以实现对pDNA和mRNA的高效递送。
新型药物设计：含二硫键的多肽在新药开发中展现出巨大潜力，例如通过肽工程和环化技术，可以提高其代谢稳定性和生物利用度，克服传统药物的局限性。
综上，含二硫键的多肽在医药领域具有广泛的应用方向，包括药物递送系统、靶向治疗、抗癌药物开发、生物活性分子稳定化、基因治疗以及新型药物设计等。这些应用展示了其在提高药物疗效、降低毒副作用和增强药物稳定性方面的巨大潜力。
（三）多肽二硫键在药物递送系统中的作用机制
含二硫键多肽在药物递送系统中的作用机制主要基于其独特的化学和生物物理特性，尤其是其在氧化还原梯度中的响应性。具体来说：
结构稳定性与保护作用：二硫键通过连接两个半胱氨酸残基形成共价交联结构，提高了药物载体的稳定性，使其在生物流体中不易降解和水解，从而保护药物分子免受外界环境的破坏。
控制释放机制：二硫键在细胞内还原环境（如谷胱甘肽浓度高的细胞质）中可被还原，触发硫醇-硫键交换反应，导致二硫键断裂并释放药物。这种机制使得药物递送系统能够在特定条件下实现精准的药物释放。
靶向递送与肿瘤治疗：二硫键常用于构建肿瘤靶向递送系统。例如，通过二硫键连接的叶酸和多柔比星前药，在肿瘤细胞内高浓度的谷胱甘肽作用下快速释放药物，从而提高治疗效果。
多功能性与自组装能力：二硫键可以与其他化学基团（如pH敏感基团、荧光标记等）结合，形成多功能的药物递送载体。这些载体能够根据外界条件（如pH、氧化还原梯度）进行自组装或解离，从而实现多阶段递送和响应性释放。
基因递送与核酸药物：二硫键在基因递送系统中也发挥重要作用。例如，通过二硫键连接的环状两亲肽能够高效递送siRNA，并在细胞内还原环境中释放有效载荷。
纳米载体与生物相容性：二硫键被广泛应用于纳米载体的设计中，如红ox响应性纳米载体，能够在肿瘤微环境中快速响应并释放药物。
含二硫键多肽在药物递送系统中的作用机制包括提高稳定性、实现控制释放、靶向递送、多功能性设计以及增强生物相容性等多个方面，为提高药物疗效和降低副作用提供了重要支持。
（四）多肽二硫键在临床试验进展以及获批药物案例
1、已上市药物
利那洛肽：一种用于治疗便秘和慢性特发性便秘的药物，其通过与鸟苷酸环化酶C型受体结合，刺激肠液分泌，增加排便频率。利那洛肽含有二硫键，这为其提供了更高的稳定性，使其能够在体内更长时间发挥作用。
图3： 一种利那洛肽胶囊制剂及其制备方法与流程
齐考诺肽：一种用于治疗慢性疼痛的药物，其通过阻断脊髓背角的N-钙通道释放神经递质，从而减轻疼痛。齐考诺肽含有三个二硫键，这些键赋予其高度的稳定性，并使其能够有效抵抗蛋白酶降解。
兰瑞肽（Lanreotide）：一种用于肢端肥大症和神经内分泌肿瘤药物，含二硫键结构增强稳定性。
1、临床阶段候选药物
RGD多肽衍生物：多个含双二硫键的环形RGD肽进入抗血管生成治疗的Ⅰ/Ⅱ期临床试验，用于实体瘤靶向治疗。
氧化还原响应型纳米药物：如DOX-ss@PMs在小鼠模型中显示高效肿瘤蓄积和低副作用，正在推进临床转化。
（六）含二硫键多肽稳定性优化技术研究
含二硫键的多肽在生物医学领域具有重要应用价值，其稳定性优化是当前研究的重点。基于我搜索到的资料，以下为含二硫键多肽稳定性优化技术的研究总结：
二硫键工程：通过在目标蛋白质结构中引入二硫键，可以显著提高蛋白质的稳定性，例如热稳定性、抗蛋白酶降解能力和生物活性。二硫键工程通常利用计算机辅助设计和分子动力学模拟来选择合适的残基进行突变，从而优化蛋白质的稳定性和功能。如在疫苗设计中，利用计算工具Disulfide by Design来预测最佳半胱氨酸对，优化二硫键拓扑结构以提高热稳定性。
环化策略：环化是提高多肽稳定性的重要方法，尤其是通过二硫键连接的环状结构，能够增强蛋白质的刚性和稳定性，同时减少代谢降解的风险。含有两个二硫键的环状多肽比线性多肽具有更高的稳定性和生物活性。例如，订书肽（stapled peptides）通过α-螺旋加固增强靶标结合力。
非共价修饰策略：除了共价修饰（如二硫键）外，还可以通过非共价相互作用（如氢键、芳香性相互作用和静电作用）来增强蛋白质的稳定性。例如，通过芳香族氨基酸与二硫键的结合，可以显著提高蛋白质的抗蛋白酶降解能力。
质谱分析：质谱技术在二硫键的定位和鉴定中发挥重要作用。通过质谱分析，可以确定二硫键的连接模式，从而为蛋白质结构的解析和功能优化提供依据。
动态二硫键：动态二硫键是一种新型的二硫键连接策略，能够在氧化还原环境中调节蛋白质的稳定性，从而在特定条件下实现蛋白质的激活或保护。这种策略在药物开发和生物技术中具有潜在应用价值。
天然来源的二硫键多肽：研究发现，天然来源的二硫键多肽具有较高的稳定性和生物活性，因此可以通过模仿这些天然结构来开发新型的稳定化策略。
二硫键的化学修饰：通过化学修饰（如二硒化物键、硫醚键等）可以进一步增强蛋白质的稳定性，但这些方法可能增加合成的复杂性。
含二硫键多肽的稳定性优化技术包括二硫键工程、环化策略、非共价修饰、质谱分析和动态二硫键等方法。这些技术在提高蛋白质的稳定性、抗降解能力和生物活性方面具有显著效果，为生物医学和药物开发提供了重要的技术支持。
（七）多肽二硫键与传统多肽药物的对比分析
（八）常见多肽二硫键序列：
1、Endothelin – 1
序列：Cys – Ser – Cys – Ser – Leu – Met – Asp – Lys – Glu – Cys – Val – Tyr – Phe – Cys – His – Leu – Asp – Ile – Ile – Trp – OH ，存在 Cys1&Cys15 Bridge、Cys3&Cys11 Bridge 。
功能：强效血管收缩剂，作用于内皮细胞及下层平滑肌细胞，调节血管张力，特异性作用于 ETA 受体 。
2、Vasiactuve lntestinal Contraetor
序列：H-Cys – Ser – Cys – Asn – Ser – Trp – Leu – Asp – Lys – Glu – Cys – Val – Tyr – Phe – Cys – His – Leu – Asp – Ile – Ile – Trp ，有 Cys1&Cys15 Bridge、Cys3&Cys11 Bridge 。
功能：对小鼠和豚鼠肠道有较高收缩活性，血管收缩活性较弱 。
3、用于二硫键形成酶研究的底物多肽（Disulfide bond）
序列：H – Asn – Arg – Cys – Ser – Gln – Gly – Cys – Trp – Asp – Asn – OH （Cys3 & Cys 8 Bridge)
功能：作为二硫键形成酶蛋白二硫键异构酶（PDI）和 DsbA（周质蛋白硫醇 – 二硫键氧化还原酶）的底物 。
4、Tyr3-Octreotate
序列：
DPhe-Cys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr (Disulfide bridge: Cys2-Cys7)功能：Tyr3-Octreotate 是一种生长抑素类似物。Tyr3-Octreotate 具有较高的肿瘤摄取率，能够被放射性金属标记，从而具被抗肿瘤活性。
5、Apamin
序列：
H2N-Cys-Asn-Cys-Lys-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Cys-Ala-Arg-Arg-Cys-Gln-Gln-His-NH2(Disulfide Bridge:Cys1-Cys11 & Cys3-Cys15)功能：Apamin (Apamine) 是在蜂毒素中发现的一种 18 个氨基酸的肽类神经毒素，是一种 Ca2+ 激活的 K+ (SK) 通道的特异性和选择性的阻断剂，具有抗炎和抗纤维化的作用。
6、CRT
序列：
H2N-Cys-Arg-Thr-Ile-Gly-Pro-Ser-Val-Cys-OH(Disulfide Bridge:Cys1-Cys9)功能：CRT 是一种铁肽模拟物，可以与载脂铁转铁蛋白 (apo-Tf) 结合以及其受体（TFR）的复合物结合，进而触发受体介导的内吞作用。CRT可用于修饰纳米颗粒，提高药物输送效率。
7、CCPs
序列：
His-Gln-Cys-His-Gln-Glu-Ser-Thr-{Cit}
-Gly-Arg-Ser-Arg-Gly-Arg-Cys-Gly-Arg-Ser-Gly-Ser (Disulfide bridge: Cys3-Cys16)功能：CCP peptide 是一种合成的环状瓜氨酸化肽 (CCP)，用作血清学检测抗 CCP 抗体的底物。CCP peptide 可作为自身抗体的靶标，对类风湿关节炎 (RA) 具有很高的特异性。
8、LyP-1
序列：
Cys-Gly-Asn-Lys-Arg-Thr-Arg-Gly-Cys(Disulfide bridge: Cys1-Cys9)功能：LyP-1 TFA 是一种环状 9 个氨基酸的肿瘤的定位肽，在多种肿瘤相关细胞中，选择性结合其 p32 receptor 蛋白。
9、cyclo TAT
序列:cyclo(
Cys-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys)（二硫键：Cys¹-Cys¹³）功能：环化版本cTAT（cyclo(CYGRKKRRQRRRC)）通过二硫键形成的环状结构不仅提高了肽的稳定性，还赋予了其良好的生物活性和药物递送能力。这种设计特别适用于大分子药物的递送，尤其是在需要精准释放和高稳定性的应用场景中具有重要价值。
10、iRGD
序列：
Cys-Arg-Gly-Asp-Lys-Gly-Pro-Asp-Cys (Disulfide bridge:Cys1-Cys9)功能：cyclo(CRGDKGPDC) 是一种具有显著肿瘤靶向性的环肽，其二硫键结构赋予了其高度稳定性和刚性，使其在肿瘤诊断和治疗中具有广泛的应用潜力。通过与生物素或荧光分子联用，可以进一步增强其靶向性和可视化能力，为精准医疗提供了新的策略。
11、Endothelin 1（ET-1）
序列：Cys – Ser – Cys – Ser – Ser – Leu – Met – Asp – Lys – Glu – Cys – Tyr – Val – Phe – Cys – His – Leu – Asp – Ile – Ile – Trp – Val – Asn – Thr – Pro – Glu – His – Val – Pro – Gly – Arg（Disulfide Bridge: Cys1-Cys15 & Cys3-Cys11)
功能：ET-1通过结合两种G蛋白偶联受体（ETA和ETB）发挥作用，其中ETA主要负责血管收缩，而ETB则参与多种生理和病理过程，如细胞增殖和炎症反应。ET-1的活性与其氨基酸序列密切相关，尤其是关键残基（如Cys、His、Trp等）对受体结合和信号传导起决定性作用。
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