摘要：树状多肽作为树枝状大分子的一种 , 具有不同于链状多肽的独特理化特性 , 在生物学领域中具有广泛的应用。本文简要综述了树状多肽的合成方法 , 及其在诱导免疫反应、生物分子模拟、免疫诊断试剂、人工酶、药物及基因载体等方面的应用。

关键词： 树状多肽 合成 应用

一、树枝状大分子及树状多肽

树枝状大分子 (dendrimer) 是一种具有规则的高度分支结构的单分散性 (monodisperse) 大分子 [1] 。最早被广泛研究和关注的树枝状大分子是1985年Tomalia合成的聚酰胺-胺 (PAMAM) 系列分子 [2, 3] 和Newkome的“树状系统” (“arborol” systems) [4] 。 早期的树枝状大分子合成多采用发散法 (divergent approach) , 直到1990年Fréchet首次在树枝状大分子的合成中介绍了收敛法 (convergent approach) [5] , 形成了树枝状大分子合成的两大方法。 树枝状大分子以其独特的树状结构, 在生物分子模拟、 催化剂、 免疫诊断试剂、 药物及基因载体、表面活性剂等方面有很多潜在用途。近年来国内外关于树枝状大分子的研究越来越受到重视, 相关论文数量也呈指数式增长。

树状多肽 (peptide dendrimer) 广义的定义指所有包含多肽的树枝状大分子 [6] , 树状多肽具有一般树枝状大分子的普遍特性, 如规则的多分支类球型结构、密集的表面集团、分子中较大的空腔等 [7—10] ;它相对于线性多肽具有更好的水溶性、更强的耐水解酶能力和对细胞更小的毒性 [11] , 其上众多的结合位点可以结合更多有用的基团, 因此树状多肽在生物化学、分子生物学及化学生物学中具有很广阔的应用前景。广义的树状多肽一般有两种情况:一种是在传统树状大分子核心上连接多肽片段作为其末端;另一种是以分支的多肽直接作为树状多肽的核心 [11] 。本文主要讨论后一种情况。1988年Tam首先介绍了以赖氨酸为核心的树状多肽 (图1) [12—14] 。

图1 Tam首先合成的赖氨酸骨架树状多肽, A、B、C、D 分别表示1、2、3、4级树状多肽

二、树状多肽的合成

树状多肽的合成主要有两种方法, 分别是传统的逐步固相合成法和化学选择及正交连接法 (chemoselective and orthogonal ligation) 。这两种方法分别对应于树枝状大分子合成的发散法和收敛法, 即前者由核心逐步向末端合成, 后者先合成需要的功能基团, 纯化后以特定的化学方法连接到树状核心上 (图2) 。

图2 发散法和收敛法的对比示意图:上面为发散法, 下面为收敛法。fr:反应性基团;fc:核心反应性基团; fp:被保护的基团

1.发散合成法

1963年Merrifield首先介绍了固相多肽合成法 [15] , 该方法简便易行, 至今已经发展成为合成多肽、寡核苷酸甚至某些有机小分子的通用方法 [16] 。发散法合成树状多肽多采用此法, 具体的合成步骤与线型多肽相同。通常合成开始于以di-Boc或di-Fmoc保护的赖氨酸合成二级或三级的分支结构, 然后其它多肽序列被一步一步合成到该赖氨酸骨架上。合成结束后, 将所得的树状多肽从树脂上切割下来, 进行进一步的提纯和表征。

随着赖氨酸级数的增加, 分子中发生链间聚集 (aggregation) 的倾向也逐渐升高。为了减轻这种效应, 发散法要求在开始合成时采用较低的树脂负荷 (loading) , 一般是0.1mmol/g树脂, 比通常固相法的0.3—0.8mmol/g树脂低得多。而阻碍连接反应的链间氢键的形成也可以通过采用特殊的溶剂组合和提高反应温度来实现 [17, 18] 。

除赖氨酸外, Crespo 等人 [19] 介绍了以顺式4-氨基-L-脯氨酸 (Amp) 为分支单位的树状多肽 (图3) 。分步发散合成法的一个变体是在赖氨酸骨架上连接不同的肽链, 该问题通过使赖氨酸的α和ε氨基端具有不同的保护基而解决, 通常分别为Boc和Fmoc (图4) 。

图3 以顺式4-氨基-L-脯氨酸 (Amp) 为分支单位的 树状多肽的合成路线

图4 Boc-Fmoc法合成具有不同支链的树状多肽

除固相合成法外, 传统发散液相多肽合成法也在树状多肽合成中得到应用。Rodriguez-Hemández等 [20] 利用氨基酸N-羧基内酸酯 (N-carboxyan-hydrides, NCAs) 发生开环聚合反应, 得到具有多聚赖氨酸长链的树状多肽, 产率较高。Baigude等 [21] 使用di-Boc保护的赖氨酸液相合成具有多糖外层的树状多肽, 作为AIDS疫苗 [21] 。Choi等 [22] 以液相多肽合成法在聚乙二醇 (poly (ethylene glycol) , PEG) 高分子两端合成赖氨酸骨架, 成为哑铃型树状多肽分子 (图5) 。

图5 哑铃型树状多肽分子

发散合成法具有简便迅速、可靠性高、中间产物不用纯化的优点。但是在合成较大的多肽时, 总产率随树状多肽级数的增加呈指数式下降, 即使每一步反应的产率很高, 4—5级反应后总产率仍然会降到不能接受的程度。尤其是目标分子分子量大于20 000时, 终产物将很难与有瑕疵的副产物分离 [23] , 此时多采用收敛合成法。

2.收敛合成法

收敛合成法与发散合成法的区别在于前者树状多肽的树状核心和外围多肽是分别合成, 继而以化学键连接的。其连接方法又分为两种主要策略, 一种是应用末端保护的多肽, 另一种是应用末端非保护的多肽。具体采用哪种合成策略主要取决于多肽。

单体的性质、树状核心的复杂度及实验室的技术条件。关于不同连接策略的方法学问题, 可参考Tam等 [24] 1999年的相关综述 (表1) 。

应用保护多肽的收敛合成法 [25] 通常使用传统的连接策略及连接试剂, 与合成线型多肽主要的区别在于要在核心上同时连接两个或更多的保护多肽。Sasaki和Kaiser [26] 1989年用此法合成了亚铁血红素蛋白 (图6) 。使用保护多肽遇到的困难是保护片段往往难以溶解及连接率较低 [27] , 于是非保护多肽连接的方法近年来得到较快的发展。

图6 Sasaki和Kaiser合成的亚铁血红素蛋白

非保护多肽连接法又称正交连接法 (orthogonal ligation) , 化学选择法 (chemoselective) , 捕获-激活法 (capture-activation) , 原位反应法 (native) , 分子间法 (intramolecular) , 或生物模拟法 (biomimetic ligation) [18] 。该方法借助于外围多肽和树状核心多肽末端的特异性化学反应 (可以是亲核-亲电反应或形成酰胺键的反应) , 由于其使用的多肽片段及树状核心都处于非保护状态, 具有更好的水溶性, 更易被RP-HPLC提纯, 因此具有更好的反应特异性。目前已经有很多正交连接的方法的报道:主要有通过形成硫酯键连接 [28—30] (图7) , 亚胺和亚酰胺连接 [17, 23, 30] (图8) 及前后相连的环化反应 [18, 27, 31] 。Tam等 [32] 综述了不同的非保护连接方法。

图7 Tam通过形成硫酯键连接两个多肽的示意图

图8 Shao等以亚胺和亚酰胺连接合成树状多肽示意图[23]

3.树状多肽的提纯和表征

固相合成的树状多肽采用传统固相多肽的方法, 即高效液相色谱法纯化。由于树状多肽所具有的特殊性质, 反相高效液相色谱分离时将会出现一个比较宽的峰, 在某种程度上造成了分离的困难 [18] 。液相法合成的树状多肽因每步反应后都有相应的纯化步骤, 故而最终产品不需要特定的手段提纯 [20—22] 。

绝大多数文献对树状多肽的表征采用了基质辅助激光解吸附电离-飞行时间质谱 (MALDI-TOF-MS) 与核磁共振 (NMR) , 另外圆二色谱、电泳、原子力显微镜 (AFM) [22] 、电喷雾质谱 (ESI-MS) 等在树状多肽的表征中也得到了应用 [23, 44] 。但有文献报道有些类型的树状多肽在ESI和MALDI-TOF质谱中得不到稳定的图谱 [18, 33] 。

三、树状多肽的应用

1988年Tam [12] 首先提出了多抗原肽 (multiple antigen peptide, MAP) 的概念, 成为树状多肽的第一个应用方面。时至今日, 树状多肽在生物化学领域几乎具有了所有一般树状大分子所具有的用途。本文将分别简要介绍这些用途。

1.树状多肽作为免疫原

如上所述, 作为免疫原是树状多肽最早和最广为人知的用途。传统的抗原肽出于诱导免疫反应的目的, 需要接在一个比较大的多肽或蛋白质上。但这种免疫原抗原决定簇密度低, 而且载体蛋白可能会诱导其他免疫反应, 而树状免疫原可以很好地克服这个缺点。树状核心上可以同时连接很多小肽, 在单位质量上有更多的抗原决定簇, 因而具有更高的抗原性, 同时兼备了易于合成、能可靠地诱导位点特异的抗体并可以诱导多样的免疫反应等优点 [6, 7, 9, 34] (图9) 。

图9 MAP示意图

图10 Tam等合成的具有多抗原决定簇的MAP

1989年Tam等 [14] 合成了具有多抗原决定簇的MAP, 该分子同时具有代表HBV病毒中S和S (2) 片段的独立抗原决定簇 (图10) , 加强了分子的免疫原性。1990年他们又合成了具有连续T细胞和B细胞抗原决定簇的MAP, 用于疟疾疫苗 (图11) [35] 。1992年, Tam研究组 [36] 又合成了具有HIV-1表面抗原gp-120和亲脂性的三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸酯基团的AIDS疫苗 (图12) 。

图11 具有连续T细胞和B细胞抗原决定簇的MAP

图12 具有gp-120和亲脂性的三棕榈酰-S- 甘油半胱氨酸酯基团的MAP

除Tam小组外, de Oliveira等 [37] 合成了具有聚赖氨酸核心和4个环行二硫肽的MAP作为口蹄疫疫苗 (图13) 。Baigude等 [21, 38] 合成了具有多糖外层的MAP, 用做AIDS疫苗。Tallima等 [39] 将血吸虫3-磷酸-甘油脱氢酶 (G3PDH) 主要多肽序列的衍生物接在MAP上, 产生了很好的免疫效果。Bisang等 [40] 合成了疟原虫环子孢子表面蛋白的环状多肽片段并连接到4分支MAP上, C端同时连接T细胞表面抗原决定簇多肽, 用于研究疟疾疫苗。

图13 de Oliveira等人合成的具有聚赖氨酸核心 和4个以二硫键形成环状肽的MAP

现在, MAPs已经被常规应用在制造抗体和细胞毒性免疫反应研究方面。对比研究显示MAPs比通常多肽-蛋白质聚合物具有更高的效能和更快的诱导抗体速度。Sadler等 [6] 的综述详细地总结了树状多肽的该用途。

2.树状多肽在免疫检验和血清诊断方面的应用

免疫检验中经常需要可以结合在固相表面的小肽作为抗原, 树状多肽因其与固相表面的易结合性和易于检测性成为该种应用的不二之选 [41, 42] 。Adesida等 [43] 利用树状多肽相对于线型多肽更强的结合力研究了免疫球蛋白与无抗原决定簇的多肽之间的直接和间接多肽-抗体结合检验。Gómara等 [44] 在MAP末端连接甲型肝炎病毒HAV的VP3衣壳蛋白, 用于酶联免疫吸附法 (ELISA) 检验HAV抗体, 发现双分支的树状多肽效果最好。

在血清诊断中, 树状多肽可以提高血清中抗体的检验灵敏度, 有利于检验早期感染产生的抗体, 特别是IgM [45] 。在最极端的一个样本检测中, 树状多肽具有相对于酶联免疫吸附检验中普通多肽抗原108倍的灵敏度。不久的将来, 当树状多肽可以直接结合在传感芯片上, 并且抗体强度能够被精确测量的时候, 免疫吸附检验也许将要被生物传感器技术所取代。表2总结了树状多肽在免疫检验和血清诊断方面的应用 [6] 。

3.树状多肽作为抑制子 (inhibitors)

树状多肽另一个确定的应用即为抑制子的设计, 抑制疟原虫进入肝细胞的实验就是一个很好的例子 [46] 。另一个基于HIV-1表面抗原gp-120中V3片段的树状多肽分子被发现具有抑制HIV-1病毒感染CD4 +和CD4 -细胞的能力 [47] 。树状多肽相对更强的结合力对于设计抑制肿瘤细胞转移的多肽具有很大意义。最近的一项研究显示, 一个具有16个层粘连蛋白 (laminin) 分枝的树状多肽在体内实验中显著地抑制了肿瘤的生长 [48] 。

4.树状多肽作为生物模拟分子 (biomimetics)

在很多自身免疫疾病的模型系统中, 树状多肽被证明可以作为蛋白质甚至DNA的替代物。具有不同周围多肽的树状多肽被用来在健康动物体内模拟系统性红斑狼疮 [49—51] 。Costa等 [52] 用MAP连接髓鞘少突神经胶质细胞糖蛋白 (myelin oligodendrocyte glycoprotein, MOG) 用于诱导大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎。Bracci等 [53] 合成了4分支MAP作为烟碱型乙酰胆碱受体 (nicotinic acetylcholine receptor, nAchR) 模拟物并与蛇毒血清结合, 显示了比单体强很多的体内活性。Mason [50] 的实验显示特定的树状多肽可以在动物体内诱导出抗自身蛋白质和DNA的抗体。Putterman和Diamond [54] 确定了一种可以在大鼠体内诱导出抗DNA抗体的双链DNA替代物, 大鼠由此产生了类似于红斑狼疮的综合证。Goodman等 [55] 用树状多肽模拟了具有超螺旋结构的胶元蛋白类似物 (图14) 。Kasai等 [56] 合成了外围富含精氨酸的MAP模拟抗癌药物血管内皮抑制素 [56] 。

图14 Goodman等人用树状多肽模拟的具有超 螺旋结构的胶元蛋白类似物示意图

5.树状多肽的抗菌作用

Azuma等 [57] 发现一个具有11个残基的外周多肽的树状多肽具有抗细菌作用, 对革兰式阳性和阴性菌都有效, 并且随着树状多肽的级数增加抗菌活性增强。Tam等 [58] 的研究发现:四肽RLYR和八肽RLYRKVYG单链均没有抗菌活性, 然而结合了4个或8个上述小肽片段残基的树状多肽具有广泛的抗细菌和真菌的活性。

6.树状多肽作为药物和基因的载体

图15 赖氨酸骨架上连接偶氮苯

作为药物和基因的载体是树枝状大分子最重要的应用之一, 树状多肽在这方面的研究同样也得到了重视。1995年Sheldon等 [59] 研究了赖氨酸骨架树状多肽穿越中华大鼠卵巢细胞 (CHO细胞) 细胞膜及核膜的能力, 讨论了树状多肽作为药物和基因的载体甚至作为细胞内荧光探针等细胞内外交通工具的可能性。Cattani-Scholz等 [60] 在赖氨酸骨架上连接偶氮苯, 得到感光的药物载体 (图15) 。Brokx等 [61] 将发色基团二氢卟吩e6 (chromophore chlorin e6, Ce6) 连接到MAP末端, 用于肿瘤细胞的光动力学疗法 (photodynamic therapy, PDT) , 光动力学活性是单体二氢卟吩e6的40—400倍。Svarracino等 [62] 将赖氨酸骨架连在DNA分子上, 发现这种DNA分子比通常DNA分子更难被核酸酶S1降解, 从而可以作为DNA分子的载体。在基因传递 (gene delivery) 领域, L-赖氨酸多聚体更是得到了很广泛的应用 [63—65] , Brown等 [66] 关于基因传递的综述中专门有一节介绍了树状多肽的应用。

7.树状多肽的其他应用

在最近的一篇报道中, Xu等 [67] 成功地将杯芳烃连在了赖氨酸骨架的末端, 得到了一种新型受体 (图16) 。Hahn等 [68] 合成了具有4个多肽分支的MAP分子, 发现其具有糜蛋白酶活性, 这是树状多肽作为人工酶的一个好例子。Kuon等 [69] 研究了连接小肽片段的MAP与细胞表面多糖的结合, 发现2分支和4分支的MAP与多糖的结合力分别是直链多肽的14倍和10 000倍。Scofield等 [70] 将MAP用于研究Ro-核糖核蛋白 (Ro-ribonucleoprotein)的蛋白质相互作用。此外, 像其它树枝状大分子一样, 树状多肽也可以作表面活性剂 [71] 。

图16 杯芳烃树状多肽

综上所述, 树状多肽作为新一代树枝状大分子, 在具有一般树枝状大分子特性的同时, 还具有合成方法成熟、水溶性好、易于修饰和改造等特点, 在生物化学、分子生物学及化学生物学中具有很广阔的应用前景。随着聚赖氨酸树状骨架的商品化和人们对树状多肽特性的进一步了解, 相信关于树状多肽的研究将会越来引人注目。

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