摘要：G蛋白偶联受体（GPCRs）是细胞表面受体中最大且多样性最丰富的家族，能够识别多种配体并调节多种生理功能。自1986年第一个GPCR被克隆并表达以来，这类受体在药物研发中的重要性逐渐显现，如今已被广泛公认为最成功的药物靶点之一。在本文中，我们将引领读者深入探讨GPCR药物发现从靶点鉴定到临床应用的全过程，重点介绍这一过程中积累的关键经验、最佳实践、面临的挑战、发展趋势和洞察。这些因素对于开发能够有效调控GPCR功能并用于治疗的药物至关重要。GPCR药物研发的前景充满希望，随着更多创新机制和新技术的涌现，开发出更有效、更成功的药物将成为可能。GPCRs是新药开发最成功的靶标之一，代表着由约821个人类基因编码的细胞表面跨膜受体的最大超家族。据估计，约34%的上市药物通过调节GPCR功能发挥作用，但大约140个GPCR的天然配体和功能仍未明确，这些受体被称为孤儿GPCRs。
GPCR药物几乎覆盖了所有治疗领域，尤其是在神经学、心血管疾病和炎症治疗中发挥重要作用。尽管针对免疫细胞的GPCR药物在肿瘤学中较为少见（如用于免疫肿瘤学的腺苷A2AR），但随着新型抗体药物偶联物（ADCs）的出现和疾病关联的不断发现，这一领域的应用将进一步扩展。专家预测，仍有60-85%的潜在治疗性GPCR未被药物开发所覆盖。值得注意的是，对于某些已批准的GPCR药物，其疗效来源于多药理学机制，无论这种机制是经过设计的（如用于2型糖尿病的共激动剂肽Tirzepatide），还是偶然的（如非典型抗精神病药氯氮平）。在药物开发过程中，获得一个合适的治疗窗口的多药理学调节是一个挑战，且在早期阶段难以预测。
所有GPCR都具备一个多功能的七跨膜结构，能够与从小质子到大蛋白质等各种大小的配体结合，并响应从光子到蛋白酶激活等多种物理刺激。GPCR的激活涉及多种复杂的生物学过程，并与多种细胞功能密切相关。由于其多样的配体和药理学特性，GPCR在生理和病理生理中扮演了重要角色，因此始终是药物发现和科学研究的热点。
在药物开发的早期，候选GPCR药物靶标需要经过严格评估，以确定其作为药物靶标的可行性、项目可执行性及投资价值。这个过程涵盖多个考虑因素，如靶标验证、疾病关联、靶标可成药性、检测可行性、多靶标选择性以及苗头化合物（Hits）发现策略等。尽管GPCR的结构和生物物理信息日益丰富且理想化，但在药物发现中前瞻性应用这些信息仍然具有较大挑战。
在介绍了药物发现的基本流程以及针对GPCR的特定苗头化合物发现方法之后，我们将深入探讨更为细致的内容。这包括高通量筛选（HTS）、药物功能的检测、机制及其驱动设计–制造–测试–分析（DMTA）周期的检测，GPCR蛋白表达，生物物理学，GPCR结构信息的洞察，作为进入药物和计算化学的过渡。这篇综述旨在探讨GPCR药物发现科学与疾病理解如何预测发展，推动新靶标、概念和有价值的药物模式，从而识别更好的药物治疗。GPCR药物发现仍然是一个具有高生产力的新药领域（例如，2021年批准的首创C5a受体拮抗剂Avacopan用于治疗血管炎）。随着如用于治疗抑郁症的迷幻剂和新的模式如偏置激动剂等趋势的出现，GPC靶标类别的新药物发现前景非常值得期待。
1.1.GPCR表达和纯化膜蛋白，包括GPCRs，由于其复杂的结构、低表达水平和不稳定性，往往难以高产量地生产和分离。GPCR表达的一个主要挑战是如何实现足够高的表达水平，以支持结构研究或功能检测等下游应用。低表达水平通常与GPCR在细胞膜中的折叠和插入过程的复杂性有关。此外，有时还需要正确的翻译后修饰才能确保功能。此外，GPCRs可能非常不稳定，容易发生展开或降解，使得获取纯净和稳定的蛋白质样品变得困难。下面将探讨克服这些挑战的策略和技术。
1.2.GPCRs过表达的细胞系统人类GPCRs的重组表达是生产结构独立的受体蛋白及通过功能评价、生物物理学参数评价及结构表征方法发现靶向这些受体蛋白的药物的重要前体步骤。GPCRs必须在能够适当处理其特定的翻译后处理和修饰的系统中表达，包括折叠和插入到膜中以及侧链的糖基化。表达系统的选择可以显著影响所产生蛋白质的质量和产量，以及生产所需的时间和成本。一些GPCRs已成功在大肠杆菌中表达；然而，大肠杆菌是一个在成功表达GPCR方面的非常有限的系统，因此，这些例子往往是例外或需要对蛋白质序列进行广泛的修改才能兼容。同样，也测试了无细胞表达系统用于生产GPCRs。有一些成功的无细胞表达GPCRs的测试案例；然而，这项技术通常比成功生产GPCR的其他系统更有限制。因此，不推荐在大肠杆菌或无细胞系统中表达GPCRs。人类胚胎肾（HEK）细胞系统更广泛地用于过度表达GPCRs。该系统为表达人类GPCRs提供了一个类似的环境，并允许进行功能性GPCR表达所需的适当翻译后修饰。然而，使用HEK细胞可能具有挑战性，因为使用这些细胞的成本高且复杂。首选的GPCR过度表达方法是使用昆虫细胞系统。这种偏好从提交给蛋白质数据库（PDB）的GPCR结构数量中可以明显看出，这些结构在Hi5、Sf9或Sf21昆虫细胞系统中表达，占总结构的三分之二。昆虫细胞是生产GPCRs的合适宿主，因为它们可以执行复杂的翻译后修饰，包括糖基化，并促进受体的正确折叠和插入膜中。与其他表达系统相比，昆虫细胞具有几个优点。它们易于大量培养，并且可以产生高产量的重组蛋白。此外，它们比哺乳动物细胞系统更便宜、更不复杂，使它们成为大规模生产GPCRs的一个有吸引力的选择。
1.3. GPCR表达的构建设计和纯化策略
重组表达GPCR蛋白时需要考虑多种因素。纯化策略对于确定必须添加到受体的标签很重要。此外，特定的分析技术可能需要额外的标签和融合。此外，受体的下游应用决定了GPCR蛋白结构的设计。例如，用于表面等离子共振（SPR）实验的GPCR构建的要求可能与用于X射线晶体学或冷冻电镜实验的要求不同。并且，在使用最天然的受体氨基酸序列和允许蛋白质以给定应用所需的规模、质量和稳定性产生的修饰之间必须进行权衡。这些修改可能包括加标签、截短、删除、插入融合蛋白和稳定突变。为了纯化GPCRs，通常需要一个纯化标签。此外，由于GPCRs的低表达产量和纯化步骤中使用的高去垢剂浓度，高度特异性的标签比常用的亲和标签（如6xHis标签）更有利。使用组氨酸标签至少需要8xHis标签，以提供对金属亲和树脂的更高特异性。或者，通常使用FLAG标签和双链strep标签，提供更大的树脂结合特异性，从而在纯化过程中的初始捕获步骤中得到更纯的产品。抗体偶联的树脂提供了最高的树脂结合特异性，但价格昂贵且树脂结合能力有限。因此，在选择合适的纯化标签时，必须考虑树脂结合特异性和容量之间的权衡。用于膜蛋白，特别是GPCRs的一种标签是将目的蛋白的天然C末端替换为来自牛视紫红质C末端的1D4表位。由于这个标签源自膜蛋白的两亲螺旋，因此添加这个标签对天然表达谱的影响比人工纯化标签更低。除了纯化标签外，还可以添加额外的序列以提高GPCR的表达和检测。例如，在GPCR序列的N末端添加可切割的流感血凝素信号序列可以帮助增加GPCR的表达水平，并为目的蛋白的纯化或检测提供另一种选择。提高GPCR目的蛋白检测的另一种方法是在目的蛋白中添加绿色荧光蛋白（GFP）融合，允许直接从细胞使用荧光信号快速评估GPCR的表达。添加GFP标签还通过使用偶联到树脂的抗GFP抗体提供纯化选项。对于使用SPR（见生物物理学部分）的生物物理受体–配体研究，常见的添加标签是avi标签，这将允许使用细菌BirA酶对蛋白质进行位点特异性生物素化。如果蛋白质与BirA酶共表达或在准备GPCRs进行SPR研究期间使用纯化的BirA进行体外使用，这种标记方法将起作用。在成功纯化后，从受体中去除额外的纯化标签是标准做法，通过在受体和纯化标签之间添加蛋白酶切割位点来实现。常用的位点包括TEV蛋白酶的ENLYFQ|(S/G)、HRV蛋白酶的LEVLFQ|GP和Factor Xa蛋白酶的IEGR|，其中“|”符号表示切割位点，括号中的氨基酸表示不分等位位置。这些蛋白酶具有高度特异性和效率，使它们成为比较主流的选择。GPCRs往往不稳定，这可能是纯化和结构确定的主要障碍。受体一旦从天然双层环境中提取出来，就会迅速展开或失去活性。为了应对使用GPCRs的这一挑战性方面，通常采用的方法是引入热稳定的点突变。虽然向GPCR序列中添加突变可能不理想，但有时为了便于使用受体是必要的。通常包括功能测试，以确保所选的突变稳定，但不干扰配体结合。这些突变可能通过减少构象灵活性来稳定，将GPCR锁定在单一状态，如活性或非活性状态。将受体锁定在单一状态对于通过X射线晶体学确定高分辨率结构很重要。通过X射线晶体学解决的所有GPCR结构中有三分之二至少经过了一种稳定突变的工程改造。已经使用了多种方法来确定膜蛋白的稳定突变。扫描突变无疑是确定稳定突变的最成功方法，其中GPCR的每个位置都突变为丙氨酸（或另一种氨基酸替代物），并使用热熔曲线测试每个突变体的稳定性。这个过程通常是迭代进行的，构建可以增加GPCR稳定性的突变组合。或者，定向进化通过随机突变也显示出在确定这些稳定突变方面的成功，其中实验负担降低，因为可以从随机突变池中选择稳定的突变。最近，计算方法，如IMPROvER和CompoMug，也已被用于通过建模、生物信息学和神经网络方法帮助预测稳定点突变。利用计算方法显著减少了劳动、成本，并提高了稳定受体目的蛋白的识别速度，然而，选定的稳定突变仍需要通过实验验证。抗体衍生物或纳米抗体与GPCR的结合可以稳定特定的受体构象，而无需修改天然受体序列，有助于促进高分辨率晶体结构的形成。然而，生产这类抗体工具所需的时间和努力使得这种方法不能被普遍使用。插入融合伙伴可以提供一个稳定的支架，可以增加GPCR的刚性并减少其构象灵活性。此外，融合蛋白增加的表面积可以促进晶体接触的形成，并提高晶体学实验的成功率。然而，与点突变一样，融合蛋白呈现非天然受体序列。在GPCR稳定中使用最受欢迎的融合伙伴是噬菌体T4溶菌酶和热稳定的细胞色素b562RIL（BRIL）。噬菌体T4溶菌酶是一个小而稳定的蛋白质，可以稳定包括GPCRs在内的广泛膜蛋白。另一方面，BRIL是细胞色素b562蛋白的热稳定变体，经过工程改造以提高其溶解度和稳定性。这些融合伙伴可以插入GPCR的不同位置，但最受欢迎的位置是细胞内环3或N末端。1.4.通过脂质成分从细胞膜上溶解并提取GPCRs
GPCRs嵌入在细胞膜的脂质双层中，提取它们需要用同时具有亲水极性基团和疏水非极性基团的双极性分子（如去垢剂）溶解。GPCRs在去垢剂胶束中的溶解是常见的，然而，这种提取过程有缺点。在溶解过程中，大多数天然脂质从蛋白质中剥离，这可能导致不稳定或非活性的蛋白质产品。为了克服这一挑战，建议在从膜中提取后采取特定步骤来稳定GPCRs。增加稳定性的一种方法是在前一节中介绍的向GPCR序列本身引入稳定点突变。然而，仔细选择用于GPCR溶解的去垢剂是另一个重要的因素，可以帮助稳定蛋白质。温和的去垢剂对GPCR的天然结构影响有限，并且在某些情况下，保留了强烈的天然蛋白质：脂质相互作用。用于结构研究的GPCR溶解最流行的去垢剂是n-癸基–β-D-麦芽糖苷、n-月桂基–β-D-麦芽糖苷、n-壬基–β-D-葡萄糖苷和月桂基麦芽糖新戊基糖醇。此外，GPCRs通常也在胆固醇半琥珀酸存在下溶解，胆固醇半琥珀酸是一种类似胆固醇的分子，已知对去垢剂溶解的GPCRs具有稳定作用。虽然去垢剂溶解法仍然是药物发现中生产GPCRs的流行方法，但新兴技术提供了一种无需去垢剂的替代方法，用于从膜中提取蛋白质。其中一种技术是使用苯乙烯马来酸（SMA）共聚物，它们可以自组装在膜双层中，并充当“饼干切割器”，从膜中切除被称为SMA脂质颗粒（SMALPs）的蛋白质/脂质盘（图1）。使用SMALPs允许在天然环境中提取GPCRs，保留它们的结构、功能，并在不需要重新组装到人工脂质环境中的情况下进入下游检测。根据下游检测的需求，GPCR可能需要以不同的可溶状态呈现，以确保其稳定性或与特定技术（如冷冻电镜（冷冻电子显微镜））的兼容性。所需的GPCR形式可能涉及将GPCR从其溶解去垢剂转移到两亲聚合物或纳米盘。两亲聚合物（如A8-35或PMAL-C8）像SMALPs一样围绕GPCR形成稳定的脂质带。同样，纳米盘由自组装的膜支架蛋白（由Apolipoprotein A-1改造而来）组成，它们环绕GPCR形成一个脂质盘（图1）。然而，GPCR必须在去垢剂中溶解后重新组装到这些系统中，因为GPCR不能直接被提取到这些系统中。与SMALPs相比，这个较长的过程存在轻微的缺点，因为必须人工添加脂质，而不是利用细胞膜中的天然脂质。此外，在纯化过程中，通常需要将溶解的GPCR从一种去垢剂胶束转移到另一种，因为最适合溶解和纯化的去垢剂可能不是最适合下游应用或长期稳定性的。Digitonin和glyco-diosgenin是冷冻电镜分析常用的去垢剂。
图1. GPCR在膜提取后的不同可溶性呈现形式。左侧的描述展示了各提取方法之间的差异，而右侧则列出了每种情况下形成活性可溶化复合物的化学物质。
荧光尺寸排除色谱法（FSEC）是一种强大的技术，可以作为筛选策略，用于在进行全面纯化之前快速评估GPCR的质量和属性。这种方法提供了一种快速有效的分析GPCR的方法，可以在不首先优化纯化过程的情况下，从粗提物中溶解。FSEC可以快速分析影响GPCR质量和稳定性的各种参数，包括不同的构建设计、用于溶解的去垢剂、缓冲成分和配体添加。该技术涉及用荧光标签标记感兴趣的蛋白质，该标签可以在尺寸排除色谱期间检测。在FSEC分析期间，蛋白质样品被注入到尺寸排除柱上，该柱根据其分子量分离蛋白质。然后通过荧光检测监测洗脱剖面，并使用所得数据评估GPCR的质量。例如，如果蛋白质以单分散峰洗脱，这表明蛋白质是均匀的并且正确折叠的。另一方面，如果蛋白质以宽峰或多个峰洗脱，则表明蛋白质聚集或错误折叠。
1.5. GPCR蛋白生物物理评估任何药物分子的生物物理参数评估对药物发现过程都很重要。它能够详细表征所讨论分子的结合亲和力和/或动力学，并以明确定义的方式确认目标参与。这些关键因素使体外生物物理技术成为目标蛋白评估的黄金标准，尽管其他的细胞内蛋白评估技术快速发展。传统上，膜蛋白，特别是GPCRs，由于其天然、未修改的构建通常在从细胞膜环境中分离出来时稳定性和活性较差，因此研究起来特别具有挑战性。然而，这种情况在过去十年中随着生物物理技术和GPCR蛋白的制备（见前一节）的进步而迅速改变，并有多个目标使用一系列技术进行研究。与任何目标一样，小分子治疗剂的性质可能使它们更具挑战性，无论是由于低分子量（如SPR）缺乏信号还是可能难以完全表征的初始候选物的较弱亲和力。
幸运的是，生物物理学家的工具箱里有许多高度灵敏且经过充分验证的技术，包括该领域的主要技术（如SPR、NMR、LC-MS和ITC（等温量热法））以及比现有技术更有优势的先进技术。这些技术在使用时也要考虑蛋白质所处的环境（例如，细胞内、溶液内/无基质、粗样混合物等）。这些技术都与结构表征紧密相连，这对于片段基础的药物发现项目同样重要，以实现更高通量的结合评估，可以与更低通量但更详细的结构评估相结合。对于许多用于评估结合亲和力的生物物理技术来说，灵敏度和通量是最重要的进展。例如，现在在合理的时间框架内对数千甚至数万种分子进行生物物理筛选越来越现实，特别是通过SPR，在某些情况下，每周可以完全表征数百种化合物的亲和力和动力学。SPR仍然是药物发现管道中的最受欢迎的技术，因为它的检测通量、灵敏度以及在标准实验中常规提供的信息量，能够表征从mM到sub-pM范围内的分子结合，除了亲和力和目标参与数据外，还可以评估化学计量和其他结合行为（不寻常的动力学、非特异性结合等），这在确认其他技术（如高通量筛选中发现）的候选物质时非常有用。
NMR（核磁共振）在评估动态系统或寻找溶液格式中的额外结构洞察方面具有几个优势，并且已在GPCR配体结合研究中使用。像MST（微量热泳动）和DSF（差示扫描荧光测定）这样的技术也提供了无基质的溶液内方法，并且能够应对复杂溶液和/或大分子量目标或难以用生物物理学表征的目标。
1.6.基于GPCR过表达细胞的活性实验
在筛选流程中，选择最合适的细胞系统对于实验成功至关重要。主要使用过表达重组GPCR蛋白的非疾病相关细胞系，如CHO-K1、U2OS、Hela和HEK293，因为它们易于操作、生长特性和广泛可用性。这些细胞系统为使用第二信使检测进行苗头化合物识别提供了充分验证和稳健的平台。然而，需要注意的是，每种细胞类型内源性的信号和调节蛋白可能会影响检测结果，并导致“系统或细胞类型偏差”，影响测试配体的药理学特性。适当的重组或内源性GPCR细胞模型对于进入体内机制受体–配体和转化研究很重要。另一个重要考虑是是否测量GPCR激活后的近端或远端信号。近端读数将减少由于较少的潜在非靶标介入而产生的不需要的假阳性频率；然而，检测窗口可能小于远端信号。远端信号从受体后信号放大中受益，提供更高的信噪比，然而，假阳性的可能性增加。总体而言，使用精心选择的一系列检测方法来识别苗头化合物（Hits），然后在正交检测中进行确认，增加了化合物后续验证成功的可能性。
从以上综述内容可以看出，将具有七次跨膜结构的GPCRs蛋白重组表达出来并作为抗原筛选药物是极有挑战的，不仅需要选择合适的去垢剂溶解并重构膜蛋白，还需要应用一系列的生物物理学方法来鉴定重构出来的GPCRs蛋白的结构正确性。因此，直接构建GPCRs蛋白过表达细胞株对蛋白结构生物学相关实验不熟练的药物研发人员而言是一条捷径。彩科生物的LyTARSTM高通量单细胞光导系统支持直接将GPCRs蛋白过表达细胞株注入筛选芯片中作为靶标来筛选抗原特异性抗体。彩科生物基于LyTARSTM系统已与合作机构开展了多个GPCR蛋白抗体筛选实验，其中一个筛选案例在如下所示。欢迎各位有合作意向的老师与我们取得联系。
【参考文献】
Addis P, Bali U, Baron F, et al. Key aspects of modern GPCR drug discovery[J]. SLAS Discovery, 2024, 29(1): 1-22.应用案例展示实验简介：基于彩科生物自主研发的LyTARSTM单细胞光导平台共筛选到104个分泌GPCR蛋白特异性抗体的浆细胞（hits）。用ELISA、流式细胞术验证重组表达抗体的结合活性，17株抗体中有9株的抗原蛋白及抗原细胞结合EC50值小于阳性对照抗体PC-1及PC-2。且其中3株与阳性对照抗体抗原表位不同的新抗体分子。
基于LyTARSTM平台的GPCR抗体筛选流程：1天/项目
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