继上篇《内吞机制和靶点分析》（点击查看），本篇重点介绍ADC药物与内吞检测
Paul Ehrlich在1903年提出了“魔法子弹”（Magic Bullet）的概念：药物可以特异性地到达预定的细胞靶点上，并且药物上的靶向分子（子弹）可以有效地杀灭目标细胞，但不影响正常健康的细胞或组织。这一概念为后续的ADC发展奠定了理论基础，并逐步被医学所重视，布局该类药物的企业逐步攀升，其药物有效性、安全性等是业界关注的重点。
ADC构成
抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugate, ADC）主要由三部分构成：抗体、连接子及细胞毒性分子，如图1所示，是一种由靶向特异性抗原的抗体通过化学连接子与具有强效的细胞毒性分子连接起来的新型癌症治疗药物。
图 1 ADC构成
ADC药物4个核心要素：
1) 靶标：在肿瘤细胞或其他目标细胞表面高表达，在正常组织或细胞中低表达或者不表达；
2) 连接子（Linker）：关注点包括：体液循环稳定性、水溶性、是否可分裂、连接方式；
3) 抗体：特异性结合靶细胞表面抗原、最佳内化效果（Internalization）；
4) 毒性小分子(Drug)：高药效，低免疫原性，能与连接子结合，Drug-to-antibody ratio（DAR），旁观者效应。
ADC作用机制
ADC经过血液循环之后，特异性地识别并结合肿瘤细胞表面上的抗原，形成“ADC-抗原复合物”，该复合物然通过受体介导的内吞作用被细胞内吞形成早期的内体，早期的内体，一部分ADC结合FcRn，通过胞转作用重新回到到细胞外，另一部分没有结合FcRn的ADC逐渐成为晚期内体，晚期内体进入溶酶体，通过溶酶体释放的酶或者相对更酸的环境，切割可裂解与不可裂解连接子，释放出毒素分子，毒素分子通过靶向破环肿瘤细胞DNA或者微管蛋白，让细胞凋亡，达到ADC药效。
另一途径可通过ADC杀伤肿瘤细胞后，凋亡细胞释放毒素小分子杀伤临近肿瘤细胞，称之为“旁观者效应”
图 2 ADC作用机制
抗体内吞检测方法
如何鉴定抗体的内化是ADC项目推进的关键，基于ADC的研究，我们需要高效、稳定、便捷、高通量的方法进行抗体内吞检测，昭衍药物发现平台可以提供以下最齐全的内吞检测服务：
流式细胞术定量测定ADC 内吞效率
该方法通过细胞表面ADC 的减少量间接测定其内吞效率。细胞表面结合抗体的内吞效率通过37℃样品相对于4℃对照样品平均荧光强度（Mean fluorescenceintensity）降低水平得出。即t时间点的内吞百分比=100－37℃样品的MFI/4 ℃样品的MFI。
作为成药性研究阶段的重要依据和临床前研究的组成部分，许多研究者用该方法进行了CD30、CD20、CD103、CD19、CD21 靶点的多种ADC 的内吞效率研究，是目前最为行之有效的方法。
共聚焦显微镜细胞内定位
共聚焦显微镜定性追踪ADC内吞后定位ADC作用部位，需要其转运至溶酶体中并切割释放出游离小分子，发挥药效。因此，直观的追踪ADC转运过程尤为重要。将ADC与感兴趣的细胞器（或细胞内部物质）标记不同种类的荧光物质，包括具有细胞透过性的细胞器荧光探针、间接免疫染色以及采用荧光标记的抗体结合细胞器的特征性蛋白等。
偶联细胞毒药物间接研究细胞内吞
利用抗体携带细胞毒药物转运进入细胞的能力，研究者们开发了同时筛选大量抗体的内吞能力。其中，常用方法为使用核糖体失活蛋白皂角素偶联的抗多种生物种属的二抗与待测抗体特异性结合后，经受体介导的内吞进入细胞中的皂角素导致细胞死亡，之后通过MTT法或CCK8等方法测定细胞活力，从而间接得到细胞对于该候选抗体的内吞能力大小。该方法具有高通量筛选内吞抗体的同时，为细胞表面一些新的ADC潜在抗原和靶位的发现提供了可靠的手段。直接将抗体与小分子细胞毒药物相连一般作为ADC 抗体筛选的最后部分，研究者开发了能高效地将候选抗体与小分子细胞毒药物相连的方法，该方法可在96 孔板中进行，利用Protein G 树脂捕获抗体，还原抗体的二硫键，暴露连接位点后与小分子细胞毒药物连接，从而筛选抗体的内吞能力。
昭衍服务内容
昭衍高通量内吞检测方法：
昭衍开发的高通量内吞检测的方法，是基于pH敏感染料标记的抗体被细胞摄入后，随着其周围环境的 pH 值酸性增强而显著增强荧光。该方法有以下优点：
简便性 — 不需要洗涤步骤或淬灭剂，减少交叉反应性或背景干扰
准确性 — 可进行定性或定量分析
高通量 — 一天可进行~5000样本的测定（对比FACS，96样品需要0.5-2hr）
低成本 — 无需复杂试剂和昂贵仪器，较传统方式价格更低。
昭衍内吞检测案例
pH敏感染料标记的抗体与细胞共同孵育，随着孵育时间延长荧光增强，候选抗体在2、4、6小时孵育后内吞显著优于对照抗体。
X代表96孔，Y代表荧光强度。可明显观测到抗体内吞效果，达到高通量、快速筛选的效果
详情咨询
电话：17320261237 赵建华
邮箱：zhaojianhua@joinn-lab.com
参考文献
[1] Engineered therapeutic antibodies with improved effector functions[J]. Cancer science. 2009; 100(9): 1566-1572.
[2] In vitro mechanisms of action of rituximab on primary non-Hodgkin lymphomas[J]. Blood. 2003; 101(3): 949-954.
[3] Murphy K, Weaver C. Janeways immunobiology[M]. Garland Science. 2016.
[4] Impact of EndocytosisMechanisms for the Receptors Targeted by the Currently Approved Antibody-DrugConjugates (ADCs)-A Necessity for Future ADC Research and Development. Pharmaceuticals(Basel). 2021 Jul; 14(7): 674.
[5] Lysosomal trafficking and cysteine protease metabolism confer target specific cytotoxicity by peptide-linked anti-CD30-auristatin conjugates[J]. J Biol Chem. 2006; 281(15): 10540-10547．
[6] Efficient elimination of B-lineage lymphomas by anti-CD20-auristatin conjugates[J]. Clin Cancer Res. 2004; 10(23): 7842-7851．
[7] Potent cytotoxicity of an auristatin-containing antibody-drug conjugate targeting melanoma cells expressing melanotransferrin /p97[J]. Mol Cancer Ther. 2006; 5(6): 1474-1482．
[8] Preclinical studies of targeted therapies for CD20-positive B lymphoid malignancies by Ofatumumab conjugated with auristatin[J]. Invest New Drugs. 2014; 32(1) : 75-86．
[9] Human monoclonal antibodies to sialyl-Lewis ( CA19. 9) with potent CDC, ADCC, and antitumor activity[J]. Clin Cancer Ｒes. 2011; 17(5): 1024-1032．
[10] Selection and characterization of antibodies from phage display libraries against internalizing membrane antigens[J]. Methods Mol Biol. 2009; 480: 113-127.
[11] 抗体偶联药物内吞作用机制的研究进展[J]. 中国新药杂志,2017,26(10):1130-1136.
昭衍新药（股份代码：603127.SH/6127.HK）是中国最早从事药物非临床评价的CRO企业，1995年成立至今，已拥有近3000人的专业技术团队。昭衍新药拥有符合国际规范的质量管理体系（CNAS/ILAC-MRA认证），具备中国NMPA、美国FDA、经合组织OECD、韩国MFDS、日本PMDA的GLP资质以及国际AAALAC（动物福利）认证资质，评价资料满足全球药品注册要求。可以向客户提供非临床药理毒理学研究及评价，特别是非临床安全性评价，临床试验及药物警戒等一站式服务；还可以提供兽药、农药及医疗器械评价等服务项目。在北京、苏州、重庆、广州、上海、梧州、南宁、云南以及美国加州、波士顿设有子公司。
昭衍秉承“服务药物创新，专注于药物全生命周期的安全性评价和监测”的宗旨，保障患者用药安全，呵护人类健康！
昭衍新药
服务药物创新，专注于药物全生命周期的安全性评价和监测，保障患者用药安全，呵护人类健康！
Website：http://www.joinnlabs.com
E-mail：info@joinnlaboratories.com
合肥科生景肽生物科技有限公司成立于2018年，目前已经打造了全球领先的以肽为核心的生命分子发现、合成生产、结构优化、递送平台，主要瞄准肽发现及靶向递送，专注于为各大制药企业、生物技术公司、科研单位提供一站式的定制化研发服务。 公司独有的KPDS™平台(KS-V Peptide Discovery Services Platform)是国际领先的的多肽药物发现平台，我们致力于创新药物的高效和精准开发，以科生景肽专有KPDS技术为核心，提供一站式，定制化的多肽发现服务，以灵活的产品形式和服务模式助力广大客户各类药物发现项目的快速推进和应用探究，包括但并不限于疾病诊断及保健功能产品、多肽药物、核素偶联药物(RDC)、基于小分子的肽药物偶联物（PDC)和多功能肽偶联物等。 中文官网地址：https://www.ks-vpeptide.com.cn/ 英文官网地址：https://www.ks-vpeptide.com
