特拉华大学团队开发「非天然氨基酸」工程策略用于蛋白质递送-Hypeptide

实现特异性精准靶向，特拉华大学团队开发「非天然氨基酸」工程策略用于蛋白质递送

1978 年，人胰岛素的成功合成标志着蛋白质药物的兴起，随着基因工程技术的进步，研究人员通过 DNA 重组在细菌或哺乳动物细胞中生产复杂的人类蛋白质。1982 年，第一款通过 DNA 重组技术生产的人造胰岛素上市，标志着现代生物制剂（蛋白质药物）进入高速发展期。

目前，蛋白质药物已经成为多种疾病的重要治疗手段，市场上涌现出多种蛋白质疗法，包括抗体、抗体-药物偶联物、生长因子、酶等，适应症涵盖心血管疾病、神经系统疾病、糖尿病、自身免疫疾病、罕见遗传病、癌症等。

统计数据显示，生物制剂在 2010-2016 年间占美国 FDA 批准的所有新药的 35%，此外生物制剂在 2012 年前十大药品销售收入中占 71%，而 2001 年仅占 7%。

现阶段，蛋白质疗法的研究热点主要聚焦于更好的药物设计，包括递送系统、结构优化以及减少免疫原性等。由于大多数蛋白质是膜不可渗透的，递送系统是蛋白质药物开发过程中至关重要的因素。

近期，美国特拉华大学化学与生物分子工程系的 Millicent Sullivan 和 Wilfred Chen 开发出一种新策略，通过非天然氨基酸（UAA）掺入，将聚集的细胞结合配体可调地掺入到荧光蛋白和酶中能够显著增加细胞特异性摄取和靶向细胞杀伤活性。

目前，这项研究已经以“Unnatural Amino Acid Engineering for Intracellular Delivery of Protein Therapeutics”为题发表在 Methods in Molecular Biology 上。

（来源：Methods in Molecular Biology）

生物偶联是一种广泛使用的修饰蛋白质以改善蛋白质递送的方法，但这种方法可能会导致蛋白质活性的变化，比如由于缺乏对修饰位点位置的控制导致蛋白质失活，因此需要改进修饰化学控制的策略。

鉴于配体呈递对蛋白质生物活性和细胞摄取的重要性，能够与细胞结合位点特异性修饰蛋白质和其他配体的生物偶联策略，为促进蛋白质递送提供了一种有价值的方法。

▲图｜使用 UAA 工程和点击化学来构建用于细胞内递送的工程荧光蛋白（来源：Methods in Molecular Biology）

在这项研究中，特拉华大学研究人员设计了一种新方法（如上图所示），利用非天然氨基酸（UAA）掺入并结合点击化学反应，将药物递送修饰位点特异性连接到蛋白质上，同时，这种通用方法能够在蛋白质或蛋白质纳米结构中添加细胞结合配体，并精确控制偶联基团的数量、密度和位置。

他们发现，荧光蛋白、自杀酶（在催化反应的同时导致自身发生不可逆性失活的酶）以及蛋白质纳米笼可以通过掺入表皮生长因子受体（EGFR）结合肽的四肽簇，通过使用 UAA 化学实现高细胞特异性靶向乳腺癌细胞。

通过将 UAA 化学与模块化 SpyTag/SpyCatcher 生物偶联方法相结合，可以将包括自杀酶酵母胞嘧啶脱氨酶（yCD）直接连接到 UAA 靶向荧光蛋白（mCherry）构建体上，从而实现了多功能递送。

无义密码子替换的 UAA 掺入是一种高保真的方法，能够将多个生物正交反应残基插入蛋白质中，具有位点特异性和对添加的 UAA 残基的位置和数量的精确控制。研究人员表示，基于对配体间距、密度和插入点的控制，UAA 工程将使蛋白质修饰能够用于细胞靶向递送且不损失活性。

在乳腺癌细胞中，yCD 与 mCherry 的连接能够通过靶向蛋白质递送和细胞特异性、yCD 触发的前药转化来有效杀死细胞。这些结果证明了 UAA 工程在细胞内递送的各种蛋白质的可调修饰中的实用性。

▲图｜将 GE11 修饰的 mCherry 构建体应用于 SUM149 细胞和 MCF10A 细胞（来源：Methods in Molecular Biology）

在很多类型的癌症治疗中，EGFR 是一个重要靶点。由于 GE11 肽对 EGFR 具有高亲和力（KD＝22nM）而成为 EGFR 靶向配体。该研究中，他们还通过递送到 SUM149 IBC 细胞（一种表达高水平 EGFR 的患者肿瘤衍生 IBC 细胞系）来评估 GE11 修饰的 mCherry 构建体的细胞靶向特异性和效率。

他们利用荧光显微镜和流式细胞仪分析发现，随着 mCherry 构建体中 GE11 肽数量的增加，蛋白质摄取和摄取特异性明显增强。此外，研究人员还证明了该递送系统的治疗潜力，并表明 UAA-mCherry 可以很容易地模块化，将其他蛋白质递送到细胞中。

总的来说，这项研究提供了一种有效、通用的策略来修饰多种蛋白质，并提高蛋白质药物临床治疗的潜力。

▲图｜美国特拉华大学化学与生物分子工程系 Millicent Sullivan 教授和 Wilfred Chen 教授（来源：University of Delaware）

主导这项研究的 Millicent Sullivan 和 Wilfred Chen 均为美国特拉华大学化学与生物分子工程系教授。其中，Millicent Sullivan 教授实验室专注于开发用于药物递送、基因递送和组织工程的新型生物材料，其治疗靶点包括转移性乳腺癌、骨修复、伤口愈合以及心血管修复等，此外她和团队最近开始探索使用工程多肽进行合成细胞设计；Wilfred Chen 教授实验室的研究重点是开发下一代生物分子工具，以解决病毒感染、疾病发病机制、生物燃料生产和蛋白质药物分离等挑战。

参考资料：

1.https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3469-1_11

2.https://cbe.udel.edu/people/faculty/msullivan/

3.https://cbe.udel.edu/people/faculty/wilfred/

素材来源官方媒体/网络新闻

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