摘 要 本文综述了多肽和蛋白质合成中的片段连接方法，这是近年来多肽和蛋白质合成领域中方法学上的重要进展。该方法使用非保护的多肽片段，无需酶或化学活化试剂，在缓冲溶液中能够高产率地获得多肽和蛋白质。还介绍了与多肽片段连接有关的肽硫酯和肽醛的合成方法。

关键词 多肽 蛋白质 片段连接 肽硫酯 肽醛

一、引 言

人类基因组序列测定工作完成以后，在人类后基因组如蛋白质组学研究中，将需要合成大量的多肽和蛋白质。近年来出现的多肽片段连接方法(peptide ligation)成为多肽和蛋白质合成领域中方法学上的又一重要进展。多肽连接是指使用非保护的多肽片段，不需要酶及化学偶联试剂的活化，通常在水溶液中即可完成的多肽接长反应，产物容易纯化，产率较高。多肽连接时对原料的N端和C端的化学结构有特定要求，由特定的N端和C端间的化学选择性反应得到连接产物。本文将以连接反应机理和产物的连接位点结构分类，介绍这方面研究的进展。

二、通过酯交换反应进行连接

这是由C端为硫酯的多肽片段与N端含有自由巯基或硒基的片段反应，在连接位点形成酰胺键，得到与天然多肽和蛋白质一致的骨架。该连接反应至少经过两个主要步骤，即硫酯交换捕获和酰基迁移反应。在连接位点可以生成的氨基酸残基包括Cys、Sec、Met、Ala和Gly。

1.生成半胱氨酸的连接

Kent的小组在1994年首先发展了在连接位点得到Cys的多肽连接方法，他们将该方法称为”天然化学连接(native chemical ligation)”。它是由C端为硫酯的多肽片段与N端为Cys的片段在pH7.6的磷酸盐缓冲液中反应得到的。首先Cys的侧链巯基与硫酯发生酯交换反应生成新的硫酯中间体，该中间体迅速通过五元环过渡态进行分子内的S→N酰基迁移反应得到以Cys残基连接的多肽终产物(图式1),该反应机理已得到了实验的证实。图中箭头表示从N端到C端的非保护多肽片段。

图 1

这是目前最简单和实用的多肽片段连接方法。Kent等人利用该方法首先制备了含72个氨基酸残基的人白介素IL-8蛋白(human interleukin 8),Shin等人合成了具有抗菌活性的糖蛋白,Tam等人则制备了含多个Cys的环状蛋白 。

2.生成硒代半胱氨酸的连接

硒与硫为同族元素，已经在几种天然酶中发现含有硒代半胱氨酸(selenocysteine,三字母缩写Sec,单字母缩写U),包括谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase)、甘氨酸还原酶(glycinereductase)、硫氧化还原蛋白还原酶(thioredoxinreductase)和碘甲状腺原氨酸5-脱碘酶(iodothyronine 5-deiodinase),Sec残基是构成这些酶活性位点的氨基酸残基之一。

3.生成蛋氨酸的连接

利用N端为高半胱氨酸(Hcy)的多肽与肽硫酯交换，经六元环过渡态发生S→N酰基迁移反应后得到连接位点为Hcy的产物，再用甲基化试剂如对硝基苯磺酸甲酯修饰可以在连接位点生成Met(图式2)]。Tam等利用该方法合成了含34个残基的副甲状腺激素(parathyroid hormone,PTH)。

图2

Yan和Dawson使用N端为Cys的肽段与肽硫酯连接，随后用H2/金属催化剂，如Pd/AlzO₃、Pd/C和Raney Ni在酸性介质中脱硫，可以把Cys残基转变为Ala残基(图式3)。他们用该方法合成了含21个残基的具有抗菌活性的环肽microcin J25,含56个残基的链球菌蛋白质G的B1片段(streptococcal protein G Bl domain),以及含110个残基的核糖酶异构体barnase。他们还使用N端Hcy肽段与肽硫酯连接，脱硫后在连接位点得到α氨基丁酸(Abu)。

图3

4.生成丙氨酸的连接

由于硒的亲核能力也很强，与前述反应机理类似，用N端为Sec的肽段与肽硫酯进行连接反应可以制备含硒的蛋白质。Hilvert等人合成了含58个残基的硒取代的小牛胰蛋白酶抑制剂(bovinepancreatic trpsin inhibitor,BPTI),Raines等人则制备了含124个残基的硒取代RNase A。

5.生成甘氨酸的连接

Low等人在N端氨基上引入1-氨基-2-巯基结构的辅助基团[HSCH₂CH(PhOMe-4)-;HSCHzCH(Ph(OMe)2-2,4)-],进行硫酯交换并发生S→N酰基迁移反应后，用酸脱去辅助基团，即可获得连接位点为Gly残基的产物。他们用该方法合成了含106个氨基酸残基的细胞色素b562(cytochromeb562)(图式4)。

图4

在以上这些连接反应中，如果原料序列中间包括Cys残基，其侧链巯基虽然能够发生硫酯交换反应生成硫酯中间体，但这些中间体经逆反应仍可以转化为原料，只有N端Cys/Sec生成的中间体能够发生酰基重排反应得到以稳定酰胺键连接的产物。原料多肽片段中的其它亲核基团，如N端氨基、Lys侧链的氨基、Arg侧链的胍基及His侧链的咪唑基均不发生竞争反应。pH7.6时反应5分钟即有产物生成，48h内完成反应。若pH<6.0,因巯基亲核性降低，反应速度明显降低。此外，还要加入过量的还原试剂以避免巯基因氧化形成二硫键而失去亲核性，常用水溶性膦化合物TCEP [tris(2-carbox yethyl)phosphine]。研究表明在这种条件下连接位点生成的氨基酸残基不会发生消旋。

Hackeng等人还对序列为LYRAX(X代表20种天然氨基酸)的肽硫酯与CRANK的肽段进行组合连接反应，发现除X为Val、Ile和Pro以外，其余17种氨基酸残基均可在48h内获得HPLC产率为100%的连接产物，其中X为Cys、His和Gly时，反应可在4h内完成。

6.肽硫酯的合成方法

本节讨论的连接方法均是多肽硫酯片段参与的连接反应。肽硫酯既可以由固相方法直接合成，也可以经液相反应将多肽的C端衍生为硫酯。

(1)固相法合成多肽硫酯

首先发展的固相合成方法是与Boc(tert-butoxycarbonyl)保护氨基酸固相合成相匹配的方法，Aimoto的 小组发展 了 由Boc-Gly-SCH2CH2CO2H与MBHA(4-methylbenzhydrylamine)树脂或PAM(4-hydroxymethylphenylacetamidomethyl polystyrene)树脂缩合得到硫酯树脂的方法，随后用该树脂逐步接长多肽，HF切割后得到C端为Gly的肽硫酯。Tam的小组改进了该方法，直接用HSCH₂CHzCO₂H与树脂缩合，然后用半胱氨酸甲酯通过硫酯交换去掉可能重复引入的HSCH₂CH₂CO₂H,随后进行逐步接长反应，由HF切割即可得到C端为任意氨基酸残基的肽硫酯。

由于用Fmoc(9-fluorenylmethoxychloroformate)保护氨基酸合成多肽时，其切割及脱侧链保护基时用三氟乙酸(TFA),比HF切割的操作简便，因而有必要发展与Fmoc化学相匹配的肽硫酯合成方法。但由Fmoc保护氨基酸合成多肽时，一般用哌啶/DMF(20:80)脱去Fmoc保护基，由于哌啶能与硫酯键的羰基发生亲核反应而将多肽从树脂上切下，因此很难得到较长的多肽硫酯。Aimoto的小组改用1-甲基吡咯烷(25%)、六亚甲基四胺(2%)、HOBt(1-hydroxybenzoyriazole)及NMP/DMSO(1:1)的混合溶液脱保护,Clippingdale等人则用DBU(1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene)与HOBt的DMF溶液脱保护,均可以成功地用Fmoc方法合成多肽硫酯。

另一种近来广为使用的方法是用 3-羧丙基磺酰胺(3-carboxypropanesulfonamide)作为连接分子，也被称作”安全连接分子(safety-catch linker)”,它对哌啶/DMF脱保护的条件稳定(图式5)。由Fmoc化学完成多肽合成后，用碘乙氰或三甲硅基偶氮甲烷(TMS-CHN2)对磺酰胺进行烷基化，再用硫醇将其从树脂上切下并硫酯化，经TFA脱去侧链保护基得到非保护的多肽硫酯。有些多肽因形成二级结构而易于聚集，使得固相合成时产率很低，Hilivert的小组报道在合成这样的肽硫酯时在硫酯化的步骤加入LiBr/THF能够将产率提高4倍。

图5

(2)由液相方法制备多肽硫酯

Kent小组使用的这种方法是由固相方法直接合成C端为硫代羧酸的多肽，随后用苄溴或由Ellman s试剂将其转变为硫酯。

三、通过亚胺进行连接

这是由肽醛与另一肽段的N端氨基进行连接，这类反应形成的连接位点不是天然氨基酸残基。一类反应连接处停止在亚胺结构，如生成肟和腙；另一类由亚胺可以进一步反应得到杂环，如连接点生成噻唑烷和四氢-β咔啉环；第三类则是在生成噻唑烷或上唑烷之后，酰基发生迁移得到酰胺产物，如生成类脯氨酸的连接。

1.生成类脯氨酸的连接

Tam等人发展的类脯氨酸连接反应是由C端肽乙醛酯与N端为Cys、Ser或Thr的肽段相连接。首先乙醛酯与N端氨基形成亚胺，紧接着巯基或羟基对亚胺进行Michael加成得到噻唑烷(thiazolidine)或上唑烷(oxozolidine),最后酰基经五元环过渡态发生S/0→N迁移反应生成更稳定的以酰胺键存在的硫杂类脯氨酸(SPro)或氧杂类脯氨酸(OPro)产物(图式6)。在该连接反应中侧链氨基即使生成亚胺，也会发生逆反应回到原料，因而不参与竞争。

图6

N端Cys与肽乙醛酯连接时，在pH5.0的缓冲液中15min即可生成噻唑烷;而N端Ser/Thr与肽乙醛酯连接时，在水溶液中反应形成上唑烷的速度很慢，但在几乎无水的溶剂中，如50%三氟乙醇与50%吡啶/乙酸(1:1)混合液中，反应30h产率可达52%-84%。酰基迁移反应一般在pH6.6-7.0之间进行，这种条件下副反应较少且速度较快。

Tam等人用该反应合成了含50个氨基酸残基的表皮生长因子(epidermal growth factor)类似物,含99个残基的HIV-1蛋白酶片段,以及含59个残基的富含脯氨酸的抗菌肽bactenecin(Bac 7)的类似物，这些类似物的活性均与天然产物的活性相似。该小组还用2D NMR技术证明了类脯氨酸连接位点中新产生的不对称碳原子为R构型，表明类脯氨酸连接是立体专一性的。研究还表明肽醛中C端氨基酸的位阻对反应速度也有影响，Gly和Ala反应最快。

2.生成噻唑烷的连接

若原料肽醛片段C端为乙醛酯以外的醛时，在与N端Cys连接后，因为不能经五元环状过渡态发生酰基重排反应，产物的连接位点停留于噻唑烷(thiazolidine)结构(图式7)。如Botti等人合成了含13个残基的环肽,Shao等人合成了含83个残基的树状多肽。

图7

3 生成四氢-β-咔啉 (tetrahydro-β-carboline) 的连接

Pictet-Spengler反应是由酸催化的醛酮与色氨酸或色氨缩合生成杂环四氢-β-咔啉衍生物的反应，被广泛用于异喹啉及吲哚类似物的合成。Li等人应用该反应，用肽醛与N端为色氨酸(Trp)的多肽片段在冰乙酸中反应24h,几乎可以定量地得到长度为17和18个残基的连接产物，连接位点为四氢-β-咔啉环(图式8)。反应中新生成的手性碳原子以两种构型存在，比例接近1:1。

图8

4.生成肟的连接

羟胺与醛生成肟(oxime)的反应是合成位点专一性蛋白质缀合物的方法之一，由Rosef和Tuschscherer等人将其应用于多肽的连接。用Boc或Fmoc保护的NH2OCHzCO2H作为合成单元，经固相合成可以方便地得到N端为NH2OCHzC(O)-衍生化的多肽片段，在弱酸性条件下与肽醛片段连接得到肟(图式9)。酸性条件下，N端未保护的氨基，Lys侧链的氨基及Arg的胍基均被质子化，因而避免了副反应。

图9

5.生成腙的连接

酰基或芳基取代的肼与醛缩合生成腙也是蛋白质化学和糖化学常用的反应之一。Offord和Rose的小组将其用于蛋白质的半合成以及制备蛋白质的位点专一性缀合物(图式9),反应同样在弱酸性条件下进行，以避免其它亲核试剂参与竞争。Shao等用Boc-NHNHC(O)CH₂CHzCO₂H],Spetzler等则用Boc-NHNHPhCOzH-p(Boc-Hob)作为合成单元用固相法直接制备了N端为NH2NH-衍生化的多肽片段,并通过与肽醛连接制备了树状多肽。

Shao和Tam还研究了以肟、肼和噻唑烷结构连接的多肽的稳定性，在24h内，噻唑烷最稳定，在pH3-9的范围内不分解，肼结构在pH5-7内稳定，pH为3和9时，24h后分别有32%和26%分解，肟在酸性和中性条件下稳定，pH=9时，24h后有21%分解。

6.肽醛的合成方法

以上连接反应均需要肽醛片段参与连接，醛基可以位于多肽的N端、C端或侧链。

N端Ser和Thr均可以被NaIO₄氧化为醛基，得到N端为醛基的多肽，室温下5min即可完成氧\n化反应](图式10)。

图10

在Lys的eNH₂上引入Ser或Thr,经NalO₄氧化可获得侧链含醛基的多肽。

C端肽醛的合成方法有多种，目前比较简便且与固相合成匹配的方法有3种。方法1是由Botti等人发展，将苯甲醛树脂与甘油反应，得到含有羟基的缩醛树脂，然后在该羟基上接入第一个氨基酸，由Fmoc保护氨基酸进行固相合成后，经TFA切割得到C端为1-甘油酯的多肽，NaIO₄氧化得到C端为乙醛酯的多肽(图式11)。Zhang等则将N-Fmoc保护的3-氨基-1,2-丙二醇直接与苯甲醛树脂反应得到含有Fmoc保护氨基的缩醛树脂，由Fmoc保护氨基酸进行固相合成后，经TFA切割得到C端为1,2-羟基丙胺的多肽酰胺，NaIO₄氧化得到C端为甘氨醛的多肽(图式11)。

图11

方法2也是由Zhang等发展的，将N-Fmoc保护的3-氨基-1,2-丙二醇直接与2-氯代的Trityl树脂相连接，得到Fmoc保护的氨基醚树脂，经Fmoc法逐步接长后，由TFA切割及NaIO₄氧化得到C端为甘氨醛的多肽(图式12)。

图12

方法3是由Lelievre等人发展的，利用Fmoc保护的氨基酸在PAM树脂上逐步接长多肽后，用 哌啶 DM F 脱除N 端保护基, T FA 脱除侧链保护 基, 随后以 H 2N CH 2CH (OM e ) 2 将树脂氨解, 用95%TFA处理6min即可获得C端为甘氨醛的多肽(图式13)。

图13

四、通过硫醚和硫酯进行连接

巯基被烷基化生成硫醚的反应可以用来选择性地修饰蛋白质[]。以硫醚连接多肽时反应在Cys侧链巯基与卤代物衍生的多肽之间进行，通常可在固相合成多肽的N端偶联氯乙酸或溴乙酸得到卤代多肽(图式14),多肽链中所有的巯基均可以反应。生成硫醚的反应速率随pH值增加而增加，但在碱性条件下巯基易氧化形成二硫键，同时卤代物的水解速度也变快，因此反应一般在pH7.5-8.0之间进行，并加入TCEP抑制二硫键的形成。Robey 、Lu¹及Beekman等人分别利用生成硫醚的连接方法制备了多肽、多肽树状化合物及多肽抗原。Englebretsen等人合成了含99个残基的HIV-1蛋白酶类似物，其Gly48Gly49以NHCH2CH2SCHzC(O)结构代替。Wilce等人合成了含127个残基的甲状腺素转移因子(transthyretin)的类似物，并折叠为具有生理活性的四聚体。

图14

也可以利用巯基与马来酰亚胺基的缺电子双键进行Michael加成反应来制备硫醚(图式15),在固相合成中可以用马来酸或其活泼酯作为合成单元得到含马来酰亚胺基的多肽,其与Cys的巯基侧链在pH7.0左右的缓冲液中加成，以减少其它亲核性侧链基团的竞争反应。如果pH>8,马来酰亚胺易水解为马来酸。

图15

如果用C端为硫代羧酸的多肽与卤代物衍生的多肽连接则得到连接点为硫酯结构的产物。Kent等人用这种连接方法得到了含99个残基的HIV-1蛋白酶类似物，并发现其可以正确折叠。但硫酯结构在中性及碱性条件下不稳定。

五、多个片段连接

两个多肽片段连接可以得到含100个左右残基的蛋白质，如果将多个片段连接，理论上可以得到任意氨基酸长度的蛋白质，但目前文献报道中仍限于150个残基以内的蛋白质。

1.顺序片段连接

顺序片段连接(sequential peptide ligation)是指将多肽依次从N→C端或从C→N端以同一种反应相连接，中间片段需要部分保护以避免自身环化或聚合，连接后脱保护露出反应基团再次连接。目前，只有生成Cys的连接法被应用于顺序片段连接。Muir等人用Msc[2-(methylsulfonyl)ethyloxycarbonyl]保护中间肽段的N端Cys,第一次连接后以碱性条件去保护，经两次从C→N端的连接得到了含95个残基的粒性白细胞——巨红细胞菌落(granulocyte-macrocyte colony)刺激因子受体的β亚结构(hβ)的类似物。也可以用Acm(acetamidomethyl)[-CH2NHCOCH3]保护N端Cys,用Hg(OAc)2/AcOH去保护进行C→N的顺序片段连接(图式16)。

图16

另一种顺序片段连接法是在第一次连接后，将连接产物衍生化使其具有活性官能团，然后再进行下一次连接。如Canne的从N→C端的顺序连接将中间肽段的C端制成一C(O)SNa,连接后通过与溴乙酸或苄溴反应将 C 端转变为活性的硫酯—C (O )SCH₂CO₂H或-C(O)SCH₂Ph,即可进行下一次连接(图式17)。通过两次Cys连接得到了含115个残基的巨噬细胞转移抑制因子(macrophage migrationinhibitory factor,MIF),以及含118个残基的人V组分泌磷脂酶A₂(human group V secretoryphospholipase A2)。

图17

2.串联片段连接

Tam的小组利用连接时溶剂及pH的不同，不需要保护中间肽段的N端或C端，进行多个片段连接。他们称该方法为串联片段连接(tandem peptideligation)。

Miao利用N端Cys及Ser/Thr肽段与肽乙醛酯反应条件的差异，由三个片段经两次类脯氨酸连接制备了含57个残基的Bac7类似物。反应从C→N端进行时，首先在水溶液中N端Cys肽段与N端Ser/Thr中间片段的肽乙醛酯反应形成硫杂脯氨酸，中间片段N端Ser/Thr在此条件下不与醛基反应，因而不需要保护；第二次连接在吡啶/乙酸溶液中进行，由连接后的N端Ser/Thr与另一个肽乙醛酯生成氧杂脯氨酸(图式18)。

图18

从N→C端连接时，因中间多肽片段的C端在开始时为1-甘油酯，不会自身反应，所以不需要保护，连接后用NaIO₄氧化得到醛后进行下一次连接(图式19)。从原理上讲，该反应可多次进行，但由于产物SPro/OPro在此条件下会发生逆反应分解，因此尚未见更多片段连接的报道。

图19

Tam和Yu等人结合生成Cys和硫杂脯氨酸的连接，由三片段经两次N→C端连接得到了含28个残基的生长激素释放抑制因子(somatostatin-28，Sm28)的类似物、含69个残基的人巨噬细胞炎症蛋白(human macrophage inflammatory proteins,MIP-1α的类似物，以及含70个残基的MIP-1β的类似物，连接位点分别为Cys和SPro,产物的活性与天然产物接近。首先在酸性条件下连接肽乙醛酯与中间肽段的N端Cys,在此条件下亚胺捕获迅速形成噻唑烷，而硫酯交换反应很慢，N端Cys的多肽片段不会自身环化成肽，因而节省了中间片段的保护。完成第一次连接后，将反应液pH值调节到大于7,得到的硫酯片段与另一个N端Cys的多肽片段交换并进行酰基迁移，得到以Cys为连接位点的产物，同时上一次连接时生成的噻唑烷也重排为硫杂脯氨酸(图式20)。

图20

六、总结与展望

固相合成技术在60个氨基酸残基以内的多肽合成中获得了极大的成功，片段缩合和片段连接方法则实现了200个氨基酸残基以内蛋白质的全合成。如果使用基因工程表达的N端Cys多肽进行片段连接，还可获得半合成的多肽或蛋白质。多肽片段连接方法尽管已引起了许多生物学家和化学家的注意，但它仍有一些需要完善的地方，例如片段连接的产物目前还局限在200个氨基酸残基以内，一次合成的样品数量一般不超过10mg。因此，固相合成技术、基因重组技术与多肽连接技术各有所长，科学家可以根据需要灵活运用几种方法, 以实现制备多肽和蛋白质的目标。

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