摘要：多肽固相化学合成法是蛋白质研究领域非常重要的研究方法之一, 主要可以分为Boc方法和Fmoc方法, 在生物药物、蛋白质工程、免疫学等研究中得到了广泛的应用。该文论述了多肽固相合成法的原理, 比较了两种典型合成方法的优缺点, 介绍了适用于该方法的多肽种类, 提出了多肽合成过程中存在的问题与解决策略, 最后展望了多肽合成法的应用前景, 以供相关领域的研究人员参考。

关键词： 多肽 Boc固相合成法 Fmoc固相合成法

1963年, 美国著名生物化学家Bruce Merrifield发明了多肽固相合成法[1]。自此以后, 多肽固相合成法被广泛应用于多肽和蛋白质的研究领域, 特别是短肽的合成, 该方法经过不断地改进和完善, 已经由原来的手工操作转变为全自动, 合成多肽的种类也日益增多。下面论述了多肽固相合成法的原理、两种典型合成方法的比较、适合于该方法的多肽种类、存在问题与解决策略、及其应用前景, 以供相关领域的研究人员参考。

1 多肽固相合成的原理

首先对组成目的肽的氨基酸进行改造, 使其成为氨基末端带有保护基的氨基酸 (这种氨基酸都可以从有关生物公司直接购买) 。将目的肽第一个氨基酸的羧基以共价键的形式与固相载体 (树脂) 相连, 再以这一氨基酸的氨基为合成起点, 使其与相邻氨基酸的羧基发生酰化反应, 形成肽键。然后让包含有这两个氨基酸的树脂肽的氨基与下一个氨基酸的羧基反应, 不断重复这一过程, 直至目的肽形成为止[2]。接着目的肽从树脂上裂解, 进行氧化折叠, 这样得到了人工合成肽的粗产品。再进行纯化, 化学修饰, 最后进行活性鉴定[3]。

其大体流程可以总结如下:

从图可以看出人工合成的多肽最初是线性的无活性, 需经过氧化折叠, 形成目的肽的天然构象后才具有生理活性。因此, 人工合成多肽 (特别是富含二硫键的目的肽, 如芋螺毒素等) 形成正确的二硫键连接方式, 形成正确的构象, 是合成有生物活性多肽的关键所在。王有良[4]等对二硫键的形成方法作了系统介绍, 每一种方法都有其优点和局限性, 这些方法所需要的具体反应条件不同, 对相关氨基酸产生的影响也不同。因此, 在合成多肽形成二硫键时, 应该根据具体情况而选择合适的氧化方法。

图1 多肽固相合成法的合成过程

2 多肽固相合成两种常用方法的比较

氨基酸在进入目的肽之前, 氨基端需要保护基。根据保护基的不同, 多肽固相合成方法可以分为两大类:Boc方法和Fmoc方法 (表1) 。这两种方法的合成原理基本相同, 但由于保护基有差异, 后面所应用的一系列试剂、条件等都发生了相应的改变

2.1 Boc (叔丁氧羰基) 多肽固相合成法

Boc方法是经典的多肽固相合成法, B Merrifield在合成血管舒缓激肽时, 就是应用Boc作为α-氨基酸的保护基。经过查阅大量的资料发现, 现在Boc方法的使用率不高。虽然Boc方法正逐渐被Fmoc方法所替代, 但是其本身的优点还是不容忽视, 有些方面值得我们借鉴和应用。如澳大利亚科学家L Miranda[5]等在利用“化学选择连接”法合成蛋白质时, 选择Boc方法合成组成蛋白质的各个片段。与Fmoc方法相比, 他们认为Boc方法更干净、更可靠, 更能快速去除α-氨基保护基。Fmoc方法则过度依赖于肽序列, 并且不能完全去除α-氨基的保护基。

2.2 Fmoc (9-芴甲氧羰基) 多肽固相合成法

R B Merrifield曾报道, 由于反应的不完全, 导致副反应产物的积累[6], 他期待固相多肽合成法的进一步完善。不负他所望, 经过四十年的历程, 固相多肽合成法已经得到了很大程度的改善。

Fmoc方法是Carpino和Han在Boc方法的基础上发展起来的一种多肽固相合成的新方法, 该方法使用的α-氨基的保护基是Fmoc。由于Fmoc对酸稳定, 易与碱作用, 所以应用碱性化合物作脱保护剂, 具有反应条件温和、副反应少、产率高等优点[7]。同时, Fmoc基团有特征性紫外吸收, 易于监测控制反应的进行[6, 8], 因此, 越来越受到人们的青睐。

表1 Boc方法和Fmoc方法常用试剂的比较

在合成具体蛋白质时, 根据蛋白质所含有的具体的氨基酸, 选择与之相适应的树脂, 第一个氨基酸与树脂结合率的高低将直接影响目的肽的最终合成量。因此在合成结构较复杂的蛋白质时, 可以将Boc方法和Fmoc方法结合使用。S He[9]等在合成被甲基化和乙酰化的组蛋白时, 利用Fmoc方法合成组蛋白H4-起源多肽苯甲基硫酯1, 2, 连接在chlorotrityl树脂上。组蛋白H3-和H4-起源多肽硫酯2, 3, 8-10利用Boc HF方法, 在甲基苯hydrylamine树脂上合成。乙酰化赖氨酸树脂和三甲基赖氨酸树脂分别应用于Boc-Lys (Ac) -OH和Boc-Lys (Me) 3-OH。

多肽固相合成法不仅可以合成具有“困难序列”的多肽, 而且可以合成需要进行化学修饰 (如C-端乙酰化) 的多肽[6]。

3 适合于固相合成的多肽种类

由于受到某些因素 (如多肽长度等) 的影响, 并非所有的多肽和蛋白质都可以通过固相合成法人工合成。该方法最适合于合成50个氨基酸以内的多肽, 这时的合成效率高。当目的肽超过50个氨基酸时, 就需要与别的方法结合使用。

3.1 短肽药物

短肽类药物序列短, 结构简单, 作用效果好, 正逐渐成为研究热点, 而目前很多短肽药物正在运用多肽固相合成法对其进行研究。如已成为药理学和神经科学的有力工具和新药开发新来源的芋螺毒素[10], 作为免疫增强剂的胸腺素α1[2, 7], 乙肝疫苗新型免疫原性多肽[11]等。J T Blanchfield[12]等已合成了具有活性的α-芋螺毒素MII的类似物。汤辉[13]等通过Fmoc方法合成了ω芋螺毒素MVIIA虎纹捕鸟蛛毒素I嵌合体HM1227, 这种嵌合体是自然界原来没有的新蛋白质。NT (Neurotensin) 是由13个氨基酸组成的多肽, 在中枢神经和周围神经系统中具有各种神经调节功能, S Luca[14]等利用Fmoc方法合成了13C、15N-标记过的NT, 观察其与GPCRG (protein-coupled receptor) NTS-1结合与否, 在结构上有何变化, 为以后的药理学研究作准备。多肽固相合成法对短肽类药物的合成效率很高, 因此该方法是短肽类药物的重要研究手段之一。

3.2 蛋白质结构域

蛋白质一般是由几个亚单位组成, 要一下子合成完整的大分子量蛋白质, 目前来说还不太可能。只能先人工合成其短序列的亚单位, 再组装成完整的蛋白质, 最后检测出其生物活性。这种方法在蛋白质工程和蛋白质功能研究中已得到广泛使用。同时通过多肽固相合成法, 还可以引进非自然氨基酸, 再检测其生物学功能[15]。C F W Becker[16]等利用Boc方法合成RBD (Ras-binding domain) 的两个片段和Ras的三个片段, 然后再分别连接成完整的有生物学活性的蛋白质。P A Wender[17]等用Fmoc方法合成了Tat49-57及其类似物, 发现它是HIV-1 Tat蛋白质的重要亚单位, 为以后研究其促进细胞吸收的作用机理提供帮助。环肽也正在进行固相多肽合成, Bourel-Bonnet L[18]等合成了海洋环肽kahalalide A及其类似物, 并且发现丝氨酸和苏氨酸在环肽中有重要作用, achiral hexanoate代替methylbutyrate后, 环肽的活性得到很大提高。

3.3 小分子量酶

众所周知, 酶在生物体内起着很大的作用, 生物体内几乎每一步生化反应都需要酶进行催化, 通过多肽固相合成法合成小分子量酶, 有利于我们对其结构和活性的认识。并且与其它方法相比, 多肽固相合成法更简单更方便。如人类的一种分泌磷酸酶 (sPLA2) 存在于血小板颗粒中, 目前对它的生理功能还不清楚。TMHackeng[19]等应用固相合成法合成sPLA2酶的片段。B USamuel和B Hearn[20]等利用Fmoc法合成寡聚精氨酸, 通过宿主细胞进入寄生虫Toxoplasma gondii等体内, 抑制ENR (enoyl-ACP reductase) 的活性, 从而消灭寄生虫。Zhang X[21]等利用Fmoc方法合成非免疫原性多肽, 这种只具有6个氨基酸的多肽能够使丝氨酸和苏氨酸等残基脱水, 同时还能催化蛋白质分子内Michael-type半胱氨酸脱氢。Qixin Leng[22]等正通过固相多肽合成法, 合成具有高转导效率的载体蛋白。

4 多肽固相合成法中存在问题及解决策略

虽然多肽固相合成法经过后人的不断改进和完善, 已经能够合成很多具有生物活性的多肽和蛋白质, 但是其本身还是存在着很多问题。如直接合成的序列短, 合成所需时间长, 合成的效率和纯度低, 成本高等。这些问题的存在大大限制了多肽固相合成法的应用范围。

4.1 合成多肽的序列短

自从B Merrifield发明了多肽固相合成法后, 多肽的化学合成成了蛋白质大量重组表达的有效互补手段, 在结构生物学、免疫学、蛋白质工程和生物药物研究中得到广泛应用。尽管在肽链合成后的性质、合成后分析等方面有很大提高, 但是当肽链残基大于30个, 尤其是超过50个时, 肽链的合成就会受到一定程度的限制。这是由于在多肽固相合成时, 对于聚合物局部来说, 合成肽的浓度较低, 在激活羧基时, 虽然使用叠氮法能有效防止外消旋的发生, 但是反应进行得相当慢[1]。因此, 由于这些种种原因, 使得多肽固相合成被局限于合成小片段多肽 (30个氨基酸以内, 少数为50个氨基酸以内) 。当合成大片段多肽时, 最好转向基因工程法廉价生产重组蛋白。

4.2 合成所需时间较长

经过三十多年的发展, 多肽固相合成的速率在合成多肽时有了很大的提高, 但是相对其它合成方式 (如生物合成法) 来说, 链的合成速率仍然很慢。每结合上一个氨基酸需要20～120min[5], 平均一个九肽的合成需要5h以上[9], 这主要取决于化学选择和接下来的合成策略。另外, 当合成较“困难”的多肽序列时, 链的结合时间更长。

4.3 合成的效率和纯度低, 成本高

即使是个氨基酸以内的小肽固相合成富含二硫键和碱性氨基酸残基的多肽合成仍比较困难, 相当一部分多肽还不能成功合成。随着氨基酸数量的增加, 合成效率逐步下降, 非目的肽含量逐步增长, 目的肽的纯度逐步降低, 后续的纯化和复性愈加困难。合成多肽的树脂和保护氨基酸等原料昂贵, 致使多肽合成的成本很高, 还不能完全满足作为药物商业化生产的要求。

4.4 合成试剂的毒性大

进行多肽合成的试剂, 其毒性很大, 如DCM、DMF、哌啶等这些有机化学试剂, 在成为废液后都需要报环保局进行处理。虽然有些仪器能提供合成过程全封闭进行, 但其排出的废气废液等, 还是对环境有污染, 不能保证百分百安全。而那些不是全封闭进行的合成反应, 有毒试剂对环境的危害则更大。因此, 随着多肽固相合成法的广泛应用, 研制开发出“绿色”合成试剂, 已迫在眉睫。

4.5 解决策略

针对上述多肽合成中存在的问题, 科学家们一直在努力解决。通过合成方法与仪器的改进来提高多肽合成效率。如利用“化学选择连接”法或者叫“多肽片连接法”可提高多肽合成的长度[23]。以传统的多肽固相合成法为基础, 首先合成50个氨基酸以内的肽片段, 然后这些肽片段再通过缩合反应, 形成完整的目的蛋白。这样, 多肽的合成速率可以达到10～15个氨基酸h, LPMiranda[5]认为“化学选择连接”法是固相多肽合成中最有发展前景的一种方法, 但是该方法也只限于40-200个氨基酸。Biron E[24]等介绍了利用Fmoc方法三步合成多肽, 同时氨基酸N端被甲基化, 大大提高了合成效率。但是还有成千上万种蛋白质不能直接用固相合成, 这些蛋白质的合成需要更新方法进行合成, 或者通过研制不易产生副反应的反应试剂, 或者改进反应条件进行人工合成。

另一方面通过改进多肽合成仪的功能, 可使合成过程完全自动化, 从而提高合成效率, 节约试剂, 降低成本。433A型多肽合成仪装有传导检测系统, 在去保护基时利用UV进行检测, 产生反馈信息, 自动控制, 使一些复杂的反应得以顺利进行, 使多肽合成达到最优化。根据我们的使用情况, 现有多肽合成仪还有很多地方需要改进, 如将裂解反应与合成反应通过密闭管路联合进行, 这样有利于避免合成肽接触空气, 防止被氧化。

从目前来看, 还有很多具体条件限制了多肽固相合成法的应用范围, 但是相信经过全世界科学家们共同努力, 在不久的将来, 随着多肽固相合成方法和工具的改进, 将会有越来越多种类的多肽和蛋白质可用固相合成法来生产, 并且合成速率及合成的效率会得到改善。

5 多肽固相合成的发展前景

有关专家认为, 肽和蛋白质将成为今后最有希望的临床治疗与保健药物;美国著名科学家、诺贝尔奖获得者朱棣文博士也曾预言:21世纪的生物工程就是研究基因工程与蛋白质工程。

直接从动物或植物中提取蛋白质或多肽, 将会造成很大的资源浪费。利用E.coli等重组表达或通过发酵液进行发酵, 纯化样品又是一大问题。而通过多肽固相合成则能够同时避免这两大问题。通过合成技术的不断成熟, 合成仪器的不断改进, 扩大可合成蛋白质的范围, 缩短合成时间, 减少合成成本等, 同时通过多肽固相合成法, 可以引进稀有氨基酸[25], 进行新的蛋白质的结构与功能的研究。多肽固相合成法在药物研究领域、蛋白质结构研究领域、免疫学研究领域等呈现着不可比拟的优越性。多肽固相合成法在生物制药及蛋白质工程中有着广阔的应用前景。

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